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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 网络生活区 » 有奖问答 » 实验讨论 » DEAE纯化蛋白
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rzrzbs

新虫 (初入文坛)

[求助] DEAE纯化蛋白

最近在用DEAE-52纯化蛋白，蛋白等电点大概为4.5因为蛋白溶解性不是很好，所以想用较高ph溶液溶（ph12.5的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液），并用这个缓冲液作为初始缓冲液以及含盐流动相，不知道可不可以

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1楼 2022-11-05 00:01:16
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

你是怎么知道你蛋白质的等电点的？

用这么碱性的缓冲液，你的蛋白质会不会失活？有没有做过预备实验？这个条件下，填料是不是比较受考验？快到耐受范围的尽头了吧？
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2022-11-07 21:44:02
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★
wolfghost: 金币+2, 积极应助奖励~ 2022-11-13 20:49:51
这个填料不太强，我从来不敢用这么碱性的溶液。

用考马斯亮蓝测得出来的蛋白质不一定是没有变性的蛋白质，要看看测定原理。

文献里的蛋白质和你的蛋白质不一定一样，除非氨基酸序列一样。
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rzrzbs
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2022-11-09 21:28:08
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rzrzbs

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2022-11-07 21:44:02
你是怎么知道你蛋白质的等电点的？

用这么碱性的缓冲液，你的蛋白质会不会失活？有没有做过预备实验？这个条件下，填料是不是比较受考验？快到耐受范围的尽头了吧？

我试过，可以洗脱出来蛋白，能用考马斯亮蓝检测出来，应该就没失活吧，而且能洗脱出来峰。等电点看的文献，我是用碱提酸沉提取的蛋白。我现在就怕长期用这种ph很大的缓冲液对填料有影响，我看说明书ph范围为3-10，在位清洗可到2-11。所以很纠结要不要换ph在它这个范围之内的缓冲液试试

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3楼2022-11-08 19:27:00
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rzrzbs

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2022-11-09 21:28:08
这个填料不太强，我从来不敢用这么碱性的溶液。

用考马斯亮蓝测得出来的蛋白质不一定是没有变性的蛋白质，要看看测定原理。

文献里的蛋白质和你的蛋白质不一定一样，除非氨基酸序列一样。

好嘞谢谢，您提的问题一针见血，回答的也很专业

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5楼2022-11-10 00:30:11
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rzrzbs

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2022-11-09 21:28:08
这个填料不太强，我从来不敢用这么碱性的溶液。

用考马斯亮蓝测得出来的蛋白质不一定是没有变性的蛋白质，要看看测定原理。

文献里的蛋白质和你的蛋白质不一定一样，除非氨基酸序列一样。

您好，现在又有问题了，我把过柱子纯化的蛋白和粗品用同样浓度和同样的溶剂（就流动相ph12.5的缓冲液）溶解，去跑电泳，结果粗品跑出来了，但纯品没有带条，不知道为什么
但我用考马斯亮蓝法测粗品和纯品的蛋白含量，发现纯品确实含量更高

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6楼2022-11-10 22:10:09
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范雪亭生物

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
rzrzbs(wolfghost代发): 金币+2, 有效应助奖励~ 2022-11-13 20:50:24
wolfghost: 博学EPI+1 2022-11-13 20:50:29
引用回帖:
3楼: Originally posted by rzrzbs at 2022-11-08 19:27:00
我试过，可以洗脱出来蛋白，能用考马斯亮蓝检测出来，应该就没失活吧，而且能洗脱出来峰。等电点看的文献，我是用碱提酸沉提取的蛋白。我现在就怕长期用这种ph很大的缓冲液对填料有影响，我看说明书ph范围为3-10， ...

电泳本身也是把蛋白变性后显示的结果，这不能说明你蛋白活性没问题，只能说明你的蛋白洗脱下来了

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7楼2022-11-11 08:10:13
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

不理解为什么跑不出来，我没遇到过这个情况，你这个蛋白质是酶吗？是什么蛋白质？
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8楼2022-11-14 13:51:33
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rzrzbs

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2022-11-14 13:51:33
不理解为什么跑不出来，我没遇到过这个情况，你这个蛋白质是酶吗？是什么蛋白质？

不是酶，是个谷物蛋白

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9楼2022-11-15 15:07:01
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

你是把稻谷粉碎之后提取得到的蛋白质？你是通过将提取液的pH调节成酸性使一部分非目标蛋白质沉淀，离心取可溶性蛋白质；再将可溶性蛋白质溶液的pH调节成碱性使一部分非目标蛋白质沉淀，离心取可溶性蛋白质；此时得到的可溶性蛋白质之中含有你的目标蛋白质？你再试图用DEAE将你的目标蛋白质纯化？
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10楼2022-11-16 10:26:26
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