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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 网络生活区 » 有奖问答 » 实验讨论 » DEAE纯化蛋白
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rzrzbs

新虫 (初入文坛)

[求助] DEAE纯化蛋白

最近在用DEAE-52纯化蛋白，蛋白等电点大概为4.5因为蛋白溶解性不是很好，所以想用较高ph溶液溶（ph12.5的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液），并用这个缓冲液作为初始缓冲液以及含盐流动相，不知道可不可以

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1楼 2022-11-05 00:01:16
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

你是怎么知道你蛋白质的等电点的？

用这么碱性的缓冲液，你的蛋白质会不会失活？有没有做过预备实验？这个条件下，填料是不是比较受考验？快到耐受范围的尽头了吧？
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2022-11-07 21:44:02
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★
wolfghost: 金币+2, 积极应助奖励~ 2022-11-13 20:49:51
这个填料不太强，我从来不敢用这么碱性的溶液。

用考马斯亮蓝测得出来的蛋白质不一定是没有变性的蛋白质，要看看测定原理。

文献里的蛋白质和你的蛋白质不一定一样，除非氨基酸序列一样。
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rzrzbs
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4楼2022-11-09 21:28:08
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

不理解为什么跑不出来，我没遇到过这个情况，你这个蛋白质是酶吗？是什么蛋白质？
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8楼2022-11-14 13:51:33
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

你是把稻谷粉碎之后提取得到的蛋白质？你是通过将提取液的pH调节成酸性使一部分非目标蛋白质沉淀，离心取可溶性蛋白质；再将可溶性蛋白质溶液的pH调节成碱性使一部分非目标蛋白质沉淀，离心取可溶性蛋白质；此时得到的可溶性蛋白质之中含有你的目标蛋白质？你再试图用DEAE将你的目标蛋白质纯化？
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10楼2022-11-16 10:26:26
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

如果不是酶，就不能通过测定酶活力的方式来判断有无目标蛋白质。你说你的目标蛋白质不是酶，那你判断样品中有没有你的目标蛋白质的标准是“SDS-PAGE所得结果，泳道中在预计分子量位置有条带”是吗？如果是这样，会不会存在你的预计大小处有别的蛋白质也存在干扰的可能？或者说你的目标蛋白质在所有谷物栽培种中都是很大很大一坨？
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11楼2022-11-16 10:31:52
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
12楼: Originally posted by rzrzbs at 2022-11-17 15:00:57
嗯嗯差不多，就是先用碱溶解原料，使碱溶性蛋白溶解，再用酸调到蛋白等电点，使蛋白沉淀，要这个沉淀的蛋白，然后再去过DEAE纯化它
...

为什么要用碱去溶解谷物？虽然有能耐受碱性的蛋白质，但耐受程度有限，你需要的蛋白质不一定能耐受，也许会变性沉淀，那你后来再跑电泳就自然没有这个蛋白质了。

你说的情况还不够详细，建议说得更详细。

建议你联系版主把这个帖子转移到“生物科学”版块，因为生物学是实验学科，大多数都没空来这个“有奖问答”版块，你发错版块了。不光没什么人回帖，还有版主把EPI授予了一个答非所问的回帖。
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rzrzbs
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13楼2022-11-23 01:17:19
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
15楼: Originally posted by 愿好_ at 2024-07-18 00:27:22
你好啊虫友们，我想问一下，冲出柱子后必须用考马斯亮蓝测吸光度吗？可不可以直接测280nm下的吸光度呀？
...

280nm测定得到的不一定是蛋白质，也有色素、黄酮等等。
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16楼2024-07-18 10:38:58
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