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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » 求助！做EMSA，蛋白与DNA不结合
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SJYyn

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助！做EMSA，蛋白与DNA不结合 已有1人参与

目前是探针做了梯度都自己泳下去了，蛋白浓度的数量级参考了文献，用了两个浓度。
我怀疑是含蛋白的溶液有问题，原本的包含蛋白的缓冲液是50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，300mM imidazole，用NaOH 调到pH 8.0，我想把蛋白换到一个不含咪唑的溶液里，且不让蛋白失活，请问应该配制什么样的PBS缓冲液呢？

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1楼 2022-04-23 12:25:55
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
盐浓度太高了（磷酸盐 50mM， NaCl, 300mM，另外NaOH调节，整体盐浓度  >350 mM），而且不建议用磷酸盐。

建议 30 mM Tris-His, pH 8.0, 50 mM NaCl 试试， good luck
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SJYyn
行至水穷处，坐看云起时
2楼2022-04-23 15:16:28
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SJYyn

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2022-04-23 15:16:28
盐浓度太高了（磷酸盐 50mM， NaCl, 300mM，另外NaOH调节，整体盐浓度  >350 mM），而且不建议用磷酸盐。

建议 30 mM Tris-His, pH 8.0, 50 mM NaCl 试试， good luck

非常感谢您的回答！请问您的意思是我的洗脱液盐浓度太高导致蛋白可能失活了吗？还是说只要把我的蛋白换到您说的溶液里就好了？

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3楼2022-04-24 21:10:22
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pennchem

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by SJYyn at 2022-04-24 21:10:22
非常感谢您的回答！请问您的意思是我的洗脱液盐浓度太高导致蛋白可能失活了吗？还是说只要把我的蛋白换到您说的溶液里就好了？
...

蛋白没有失活，只是盐浓度太高，破坏了蛋白和核酸之间的互相作用。
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行至水穷处，坐看云起时
4楼2022-04-25 08:57:39
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SJYyn

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by pennchem at 2022-04-25 08:57:39
蛋白没有失活，只是盐浓度太高，破坏了蛋白和核酸之间的互相作用。...

好的，那我就把它换到您说的溶液里试试，非常感谢您的指导！

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5楼2022-04-25 11:05:12
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