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SJYyn

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助!做EMSA,蛋白与DNA不结合已有1人参与

目前是探针做了梯度都自己泳下去了,蛋白浓度的数量级参考了文献,用了两个浓度。
我怀疑是含蛋白的溶液有问题,原本的包含蛋白的缓冲液是50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,300mM imidazole,用NaOH 调到pH 8.0,我想把蛋白换到一个不含咪唑的溶液里,且不让蛋白失活,请问应该配制什么样的PBS缓冲液呢?

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pennchem

专家顾问 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by SJYyn at 2022-04-24 21:10:22
非常感谢您的回答!请问您的意思是我的洗脱液盐浓度太高导致蛋白可能失活了吗?还是说只要把我的蛋白换到您说的溶液里就好了?
...

蛋白没有失活,只是盐浓度太高,破坏了蛋白和核酸之间的互相作用。
行至水穷处,坐看云起时
4楼2022-04-25 08:57:39
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
盐浓度太高了(磷酸盐 50mM, NaCl, 300mM,另外NaOH调节,整体盐浓度  >350 mM),而且不建议用磷酸盐。

建议 30 mM Tris-His, pH 8.0, 50 mM NaCl 试试, good luck

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行至水穷处,坐看云起时
2楼2022-04-23 15:16:28
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SJYyn

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2022-04-23 15:16:28
盐浓度太高了(磷酸盐 50mM, NaCl, 300mM,另外NaOH调节,整体盐浓度  >350 mM),而且不建议用磷酸盐。

建议 30 mM Tris-His, pH 8.0, 50 mM NaCl 试试, good luck

非常感谢您的回答!请问您的意思是我的洗脱液盐浓度太高导致蛋白可能失活了吗?还是说只要把我的蛋白换到您说的溶液里就好了?

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3楼2022-04-24 21:10:22
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SJYyn

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by pennchem at 2022-04-25 08:57:39
蛋白没有失活,只是盐浓度太高,破坏了蛋白和核酸之间的互相作用。...

好的,那我就把它换到您说的溶液里试试,非常感谢您的指导!

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5楼2022-04-25 11:05:12
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