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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 肺克基因敲除问题
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garakutadoll

新虫 (初入文坛)
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肺克基因敲除问题
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本人采用red重组敲除，目的片段750bp左右，先电转入含四环素抗性的pKD46质粒，然后用阿拉伯糖诱导重组酶表达后制作成感受态，电击转化入重组片段（含上下游同源臂各250bp，卡那霉素抗性基因作为插入片段，总长2000bp），但是第二天平板上都没有菌落生长

考虑问题：1.重组片段是不是太长，与目的基因长度相差太大导致重组失败

2.电转效率低，当时电转质粒时只获得一个克隆，可能是感受态制作不行？肺克荚膜很厚，离心的时候很难离到底，是否有解决方法？能否用固体培养基做阿拉伯糖的诱导？

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1楼 2021-09-03 12:42:15
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张小蛋

新虫 (小有名气)
★
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我敲除的是大肠杆菌，上下同源臂200多bp,筛选标记也是卡纳，整个重组片段4000bp左右，转化完后长了三十多个菌落，片段都敲上去了，但是发现好像完成的是单交换，野生型和重组片段都能检测出来，也很是头疼，估计你这个首先要解决的是电转效率的问题

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14楼2021-09-04 11:13:51
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粥小怡

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
您好，请问您的问题解决了吗？是因为片段太大了吗？

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22楼2021-10-31 00:55:30
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garakutadoll

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 粥小怡 at 2021-10-31 00:55:30
您好，请问您的问题解决了吗？是因为片段太大了吗？

解决了，用50bp的同源臂成功了
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23楼2021-12-06 13:01:49
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garakutadoll

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 张小蛋 at 2021-09-04 11:13:51
我敲除的是大肠杆菌，上下同源臂200多bp,筛选标记也是卡纳，整个重组片段4000bp左右，转化完后长了三十多个菌落，片段都敲上去了，但是发现好像完成的是单交换，野生型和重组片段都能检测出来，也很是头疼，估计你这 ...

多挑几个LB培养过夜再测，我做出来了，测了快30个菌落才有一个双交换
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24楼2021-12-06 13:03:30
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sh孙浩

新虫 (小有名气)
加一下wx 15137688280 同做质粒的

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25楼2021-12-07 10:04:22
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MAIT

新虫 (小有名气)
请问楼主解决了吗？

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26楼2022-04-28 00:26:56
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lucklizhen

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这个敲除我可以帮你做，愿意的话私信吧

[ 发自手机版 https://muchong.com/3g ]
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27楼2022-04-30 12:24:11
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秋土豆香2楼
2021-09-03 12:49   回复  
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tzynew3楼
2021-09-03 12:50   回复  
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Miya0074楼
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whiteheads5楼
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wyj9706楼
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南宫紫玉7楼
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muhong19828楼
2021-09-03 13:43   回复  
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nono20099楼
2021-09-03 14:14   回复  
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stylelife610楼
2021-09-03 15:54   回复  
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Michael98911楼
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阿文52112楼
2021-09-03 22:02   回复  
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张小蛋13楼
2021-09-04 11:10   回复  
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逐梦而来15楼
2021-09-04 22:47   回复  
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willzhuu16楼
2021-09-05 19:34   回复  
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冰山雪莲灯17楼
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Acov18楼
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