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garakutadoll

新虫 (初入文坛)


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肺克基因敲除问题
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本人采用red重组敲除,目的片段750bp左右,先电转入含四环素抗性的pKD46质粒,然后用阿拉伯糖诱导重组酶表达后制作成感受态,电击转化入重组片段(含上下游同源臂各250bp,卡那霉素抗性基因作为插入片段,总长2000bp),但是第二天平板上都没有菌落生长

考虑问题:1.重组片段是不是太长,与目的基因长度相差太大导致重组失败

2.电转效率低,当时电转质粒时只获得一个克隆,可能是感受态制作不行?肺克荚膜很厚,离心的时候很难离到底,是否有解决方法?能否用固体培养基做阿拉伯糖的诱导?

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lucklizhen

新虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
这个敲除我可以帮你做,愿意的话私信吧

[ 发自手机版 https://muchong.com/3g ]
27楼2022-04-30 12:24:11
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张小蛋

新虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我敲除的是大肠杆菌,上下同源臂200多bp,筛选标记也是卡纳,整个重组片段4000bp左右,转化完后长了三十多个菌落,片段都敲上去了,但是发现好像完成的是单交换,野生型和重组片段都能检测出来,也很是头疼,估计你这个首先要解决的是电转效率的问题

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14楼2021-09-04 11:13:51
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2021-09-03 12:49   回复  
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tzynew3楼
2021-09-03 12:50   回复  
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Miya0074楼
2021-09-03 13:12   回复  
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wyj9706楼
2021-09-03 13:33   回复  
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nono20099楼
2021-09-03 14:14   回复  
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stylelife610楼
2021-09-03 15:54   回复  
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Michael98911楼
2021-09-03 19:17   回复  
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阿文52112楼
2021-09-03 22:02   回复  
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张小蛋13楼
2021-09-04 11:10   回复  
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