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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 肺克基因敲除问题
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garakutadoll

新虫 (初入文坛)
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肺克基因敲除问题
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本人采用red重组敲除，目的片段750bp左右，先电转入含四环素抗性的pKD46质粒，然后用阿拉伯糖诱导重组酶表达后制作成感受态，电击转化入重组片段（含上下游同源臂各250bp，卡那霉素抗性基因作为插入片段，总长2000bp），但是第二天平板上都没有菌落生长

考虑问题：1.重组片段是不是太长，与目的基因长度相差太大导致重组失败

2.电转效率低，当时电转质粒时只获得一个克隆，可能是感受态制作不行？肺克荚膜很厚，离心的时候很难离到底，是否有解决方法？能否用固体培养基做阿拉伯糖的诱导？

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1楼2021-09-03 12:42:15
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garakutadoll

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 粥小怡 at 2021-10-31 00:55:30
您好，请问您的问题解决了吗？是因为片段太大了吗？

解决了，用50bp的同源臂成功了
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23楼2021-12-06 13:01:49
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garakutadoll

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 张小蛋 at 2021-09-04 11:13:51
我敲除的是大肠杆菌，上下同源臂200多bp,筛选标记也是卡纳，整个重组片段4000bp左右，转化完后长了三十多个菌落，片段都敲上去了，但是发现好像完成的是单交换，野生型和重组片段都能检测出来，也很是头疼，估计你这 ...

多挑几个LB培养过夜再测，我做出来了，测了快30个菌落才有一个双交换
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24楼2021-12-06 13:03:30
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