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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 质粒酶切求助！
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houjinglhy

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[交流] 质粒酶切求助！

请问高手关于酶切方面的问题，
是这样的：
我做的是质粒双酶切，每个酶单独切的时候都能很好的切成线性（条带跑得慢）
为什么我双切的时候，老切不开
小片段的条带很糊，根本看不出明显的条带（感觉前面那条带都有点糊）
大条带也很宽！
无论是双酶切，还是单酶切（分开切）我都试过了
酶切的设计方面应该没问题，都是单切点
请问，想上面这种情况最可能是什么问题
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从小就学习鲁迅，直到现在才体会到他当时是多么的绝望和无助，却仍要用尽最后一丝力气声嘶力竭的呐喊！
1楼 2009-08-14 16:37:49
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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★
houjinglhy(金币+1,VIP+0):我也分开切了 都是切胶回收的 只能切开一个口 第二次切就不行了 8-14 18:15
我也遇到这样的问题,我打算不双酶切了,分步酶切算了,就多个切胶回收和柱纯化.免得每次郁闷.
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2009-08-14 17:52:03
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smallcat227

木虫 (著名写手)
★
houjinglhy(金币+1,VIP+0):谢谢，我是按最大效率的酶buffer用的 分开切我也试过了 一样不行 8-14 18:14
引用回帖:
Originally posted by houjinglhy at 2009-8-14 16:37:
请问高手关于酶切方面的问题，
是这样的：
我做的是质粒双酶切，每个酶单独切的时候都能很好的切成线性（条带跑得慢）
为什么我双切的时候，老切不开
小片段的条带很糊，根本看不出明显的条带（感觉前面那条带 ...

楼主有图吗？

双酶切的缓冲液是按照试剂说明使用的吗？结果不好的话就像楼上说的那样分步酶切回收再酶切吧，注意顺序不要搞错
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3楼2009-08-14 17:55:24
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shensc727

金虫 (小有名气)
★
houjinglhy(金币+1,VIP+0):差距大 1.5KB 和 3.5 KB 谢谢你 8-14 18:35
你的小片段 有多小？大的有多大？差距很大吗？
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4楼2009-08-14 18:30:42
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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小片段切下来也就几十bp吧,这样的片段能看见么跑胶?我没有看到过哦.
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5楼2009-08-14 19:11:55
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
houjinglhy(金币+4,VIP+0):你很有经验啊 我试试吧 谢谢了 8-14 20:03
双切得难处主要在于两种酶共用的缓冲液不好选取，请楼主再检查一下你用的两种酶的共用BUFFER，同时还要注意反应条件。我也经常做双切，楼主的情况我也遇到过。出现这样的情况往往是切不全，导致复杂的缠绕物产生，所以出现了弥散或模糊的情况；另外也有可能是酶出现了星号活性，导致复杂的产物产生。
所以，可以尝试优化反应条件，如加大酶量，加大质粒浓度，缩小反应体积等方法。。实在不行，则可以一步一步切，不过要加大量，否则，最后回收的浓度可能就很小了
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6楼2009-08-14 19:34:41
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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★ ★ ★ ★
houjinglhy(金币+3,VIP+0):谢谢啊 呵呵 半个月就出克隆了 很不错了 我也希望能再下个星期完成！ 哈 8-14 20:02
司马诸葛(金币+1,VIP+0):奖励一下 8-14 20:57
两个酶单酶切都能切开那证明载体上的这两个酶切位点是没有问题的,所以分步单酶切理论上不存在切不开的问题.

我觉得楼主不要看那个几十bp的小片段了,也不能拿这个说事儿,你连一把试试看.不放心的话可以载体去鳞酸化.

多做几个对照,我也是今天下午才克隆出来,半个月了才克隆好.就是分步酶切然后切完加热失活,再加入1ul的SAP,去鳞,最后是用柱纯化的.

目的片段是双酶切后柱纯化,连接转化,挑了10个,全是阳性克隆.

祝好运.
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7楼2009-08-14 19:49:27
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
houjinglhy(金币+1,VIP+0):谢谢你的提醒！ 我现在真正优化条件 8-15 22:52
我只怕你切开了你也不知道。
小片段模糊是很正常的，比如10kb的质粒，切下来1kb的目的片段，剩余载体为9kb，电泳上样100ng的时候，大片段为90ng，小片段仅有10ng，如果你上样量太少，再加上跑电泳的时间没控制好，经常是看不到小片段的，想知道有没有切开，一是加大上样量，另是做电泳的时候将酶切的质粒和没切的质粒放在一起电泳，通过对比就可以看出来了
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8楼2009-08-15 14:02:01
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