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houjinglhy

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[交流] 质粒酶切求助!

请问高手关于酶切方面的问题,
是这样的:
我做的是质粒双酶切,每个酶单独切的时候都能很好的切成线性(条带跑得慢)
为什么我双切的时候,老切不开
小片段的条带很糊,根本看不出明显的条带(感觉前面那条带都有点糊)
大条带也很宽!
无论是双酶切,还是单酶切(分开切)我都试过了
酶切的设计方面应该没问题,都是单切点
请问,想上面这种情况最可能是什么问题
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从小就学习鲁迅,直到现在才体会到他当时是多么的绝望和无助,却仍要用尽最后一丝力气声嘶力竭的呐喊!
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spiderboy

金虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
houjinglhy(金币+4,VIP+0):你很有经验啊 我试试吧 谢谢了 8-14 20:03
双切得难处主要在于两种酶共用的缓冲液不好选取,请楼主再检查一下你用的两种酶的共用BUFFER,同时还要注意反应条件。我也经常做双切,楼主的情况我也遇到过。出现这样的情况往往是切不全,导致复杂的缠绕物产生,所以出现了弥散或模糊的情况;另外也有可能是酶出现了星号活性,导致复杂的产物产生。
所以,可以尝试优化反应条件,如加大酶量,加大质粒浓度,缩小反应体积等方法。。实在不行,则可以一步一步切,不过要加大量,否则,最后回收的浓度可能就很小了
6楼2009-08-14 19:34:41
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