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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 原核表达及诱导
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feitiannongying

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 原核表达及诱导

导师给的课题是将拟南芥一个膜蛋白基因构建到原核表达载体进行体外诱导表达。我用的表达载体是pET30a，然后转到BL21（DE3）中进行诱导表达。在BL21（DE3）中进行诱导表达时，诱导时间用过3h、4h、5h、6h、8h，IPTG浓度用过15uM 、300uM 、500uM 、800uM、1000uM的，温度是37℃，转速是200 rpm左右；在BL21（DE3）pLysS中进行诱导表达时，诱导时间用过4h、6h、，IPTG浓度用过15uM 、500uM 、1000uM的，温度是37℃，转速是200 rpm左右；在这两种宿主菌中诱导后跑SDS-PAGE发现转化子的和空载体的跑出的条带没有任何差别。重组载体没问题，测序正确并且没有移码。
从今年的3月份实习一直到现在我都在做这个课题，从一开始实验就很不顺利，到七月份才做到原核表达，而到现在还没表达出来，真的快要疯了，恳请有经验的师兄师姐给指点一下。谢谢！！

[ Last edited by amisking on 2009-8-18 at 22:12 ]
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1楼 2009-08-13 09:28:50
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★ ★ ★
feitiannongying(金币+1,VIP+0):谢谢！ 8-13 11:36
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-20 20:17
原核表达已经是很成熟的技术，没有多少可以改进的空间
除非你能改变蛋白的氨基酸序列，如融合表达，截短你的目的蛋白等
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2楼2009-08-13 09:52:06
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2004371310

木虫 (著名写手)
★ ★
司马诸葛(金币+1,VIP+0): 8-13 10:58
feitiannongying(金币+1,VIP+0): 8-13 11:36
诱导时的温度一般是用28-20度的，不能用37度，要用37度摇到一定OD后再用30度来诱导
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3楼2009-08-13 10:39:38
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zhuangyu8188

铁虫 (小有名气)
★
feitiannongying(金币+1,VIP+0): 8-13 11:36
引用回帖:
Originally posted by 2004371310 at 2009-8-13 10:39:
诱导时的温度一般是用28-20度的，不能用37度，要用37度摇到一定OD后再用30度来诱导

同意，建议你看一下Novagen原核表达宝典(PET系统操作手册)，应该有所收获。
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4楼2009-08-13 10:53:32
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tancf

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
feitiannongying(金币+1,VIP+0): 8-13 11:36
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-20 20:17
诱导温度你可以设几个梯度试验一下，我们实验室几个蛋白用的诱导温度从15度到37度不等的，并且诱导时间差的也比较大，还有诱导24H的。
膜蛋白好像真是比较难做的，要加油哦。
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5楼2009-08-13 10:56:17
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feitiannongying

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):祝你成功！ 8-20 20:18
谢谢各位的指点，诱导温度也试过30度的，也是不行。BL21（DE3）和BL21（DE3）pLysS应该是有差别的吧。我现在最头疼的是不管怎么诱导空载体的和转化子的就是没差别，跑出的条带位置都一样，很无奈。
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6楼2009-08-13 11:42:14
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★
feitiannongying(金币+1,VIP+0): 8-13 14:11
你的目的蛋白是真核生物的,有时候真核生物和原核表达系统兼不兼容是个问题啊.
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
7楼2009-08-13 12:03:51
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walingliu

铁杆木虫 (著名写手)
★
feitiannongying(金币+1,VIP+0): 8-13 14:11
膜蛋白确实是比较难做的，加油吧，祝你好运！
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失败只有一种那就是半途而废！
8楼2009-08-13 12:45:28
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panacea007

银虫 (小有名气)
★ ★
feitiannongying(金币+2,VIP+0): 8-13 14:12
膜蛋白是难度。
我用pet-25b，一般IPTG浓度不超过1 mM，足够了。加多了，对菌体有毒害作用。

[ Last edited by panacea007 on 2009-8-13 at 14:34 ]
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9楼2009-08-13 13:02:00
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feitiannongying

铁杆木虫 (著名写手)
就我查到的国内做原核诱导表达的文章IPTG浓度大部分用的是0.5mM的，也有用1mM的，用1uM浓度IPTG的文章我还没发现过。这个建议我会考虑的，谢谢！只要有希望我是不会放弃的。
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10楼2009-08-13 14:18:01
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