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lostunit新虫 (小有名气)
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表达的蛋白质用tev酶切割后，目标蛋白无法与原蛋白分离
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我的蛋白在表达后需要用tev酶切除His标签，可是切完后总是切不完，而且切下来的目标蛋白好像会和原蛋白有相互作用，无法再用Ni-NTA分离(切下来的目标蛋白已经没有了his标签，却无法从镍柱上洗脱下来，之后用凝胶层析也无法将原蛋白和切下来的蛋白分离，SDSPAGE显示两种蛋白在同一个峰里)。 现在我考虑的是两种方法: 1. 提高tev酶的活性，将原蛋白尽量全部酶切，只剩下目标蛋白和切下来的his标签，这样就能分离出目标蛋白。但尝试很多条件都无法达到，总是剩下大概一半的蛋白切不动。 2. 添加一些试剂破坏原蛋白和目标蛋白的相互作用。我的蛋白里有很多二硫键，所以试过GSH和GSSG，但没有用。 大家有没有什么好方法呢？ @飞约疯人院 @wizardfan @biostar2009 发自小木虫Android客户端 |
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2楼2021-01-25 22:30:54
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3楼2021-01-26 07:24:28
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4楼2021-01-26 07:25:37
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5楼2021-01-26 08:30:00
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6楼2021-01-26 08:32:36
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9楼2021-01-27 16:07:00
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1. Cys多，形成分子间聚集体。验证：还原非还原电泳，一份样品Loading Buffer加还原剂，另一方样品不加，电泳比较是否形成二硫键聚集体。是的话加还原剂，如β-ME，DTT，TCEP，加之前确认一下填料对不同还原剂的耐受量，不同填料差异是比较大的。 2. Cys的巯基也是可以和Ni填料结合的，但作用力弱于His，如果有多个Cys，His或其它能结合的氨基酸侧链在空间上比较接近，就容易结合填料，一般的处理方法是加低浓度的咪唑来竞争结合。Cys多的话，还原剂也加上。 3. 不知道你用的是哪种Ni填料，但通常使用的多是羧酸类配基的填料，也就会存在一定的离子相互作用，Ni填料的使用一般要求盐浓度最好在300mM NaCl以上，可以降低蛋白与填料间，以及蛋白分子间的静电吸引力。对于带异种电荷残基比较多的蛋白，盐浓度最好再高点。 4. 酶切切不完全，如果酶本身没有问题，酶切体系也没问题，那么就是蛋白的问题，多半是蛋白的酶切位点没有较好地暴露出来。如果不考虑酶切位点被部分折叠进了蛋白内部的情况，多半是蛋白分子间形成了可溶性聚集体，导致部分位于聚集体表层的蛋白的酶切位点可以被识别，而在聚集体内部的酶切位点无法暴露切割。可能是原因：如果是疏水作用主导的聚集，大概率会形成更大的包涵体沉淀，所以我个人更倾向于认为是二硫键错配交联或二硫键错配与静电吸引力共同主导的聚集。如果是前者，在酶切时还是加足够的还原剂，如果是后者就需要补加足够的盐（但TEV的酶活受盐浓度影响）。如果是我，我会把TEV酶切位点改掉，比如换成更好用的3C位点或者sumo标签。万一疏水作用比较明显，可以加低浓度的尿素或盐酸胍来竞争氢键。 |
10楼2021-01-28 15:01:32
