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lostunit

新虫 (小有名气)

[求助] 表达的蛋白质用tev酶切割后，目标蛋白无法与原蛋白分离

我的蛋白在表达后需要用tev酶切除His标签，可是切完后总是切不完，而且切下来的目标蛋白好像会和原蛋白有相互作用，无法再用Ni-NTA分离(切下来的目标蛋白已经没有了his标签，却无法从镍柱上洗脱下来，之后用凝胶层析也无法将原蛋白和切下来的蛋白分离，SDSPAGE显示两种蛋白在同一个峰里)。
现在我考虑的是两种方法:
1. 提高tev酶的活性，将原蛋白尽量全部酶切，只剩下目标蛋白和切下来的his标签，这样就能分离出目标蛋白。但尝试很多条件都无法达到，总是剩下大概一半的蛋白切不动。
2. 添加一些试剂破坏原蛋白和目标蛋白的相互作用。我的蛋白里有很多二硫键，所以试过GSH和GSSG，但没有用。
大家有没有什么好方法呢？

@飞约疯人院 @wizardfan @biostar2009 发自小木虫Android客户端
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1楼 2021-01-25 21:22:30
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yuanbingzhan


发自小木虫Android客户端
8楼2021-01-27 09:12:18
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yuanbingzhan


发自小木虫Android客户端
2楼2021-01-25 22:30:54
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
确定是有相互作用？切完后你的目的蛋白应该在穿透液中或者在低浓度(小于50mM)咪唑洗脱中。

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3楼2021-01-26 07:24:28
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
要么你用柱上酶切。也可以。有相互作用就加点吐温（疏水相互作用），或者加点还原剂

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生物资源交流QQ群：1044518333
4楼2021-01-26 07:25:37
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