| 查看: 1803 | 回复: 9 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者lostunit将赠送您 10 个金币 | ||
lostunit新虫 (小有名气)
|
[求助]
表达的蛋白质用tev酶切割后，目标蛋白无法与原蛋白分离
|
|
|
我的蛋白在表达后需要用tev酶切除His标签，可是切完后总是切不完，而且切下来的目标蛋白好像会和原蛋白有相互作用，无法再用Ni-NTA分离(切下来的目标蛋白已经没有了his标签，却无法从镍柱上洗脱下来，之后用凝胶层析也无法将原蛋白和切下来的蛋白分离，SDSPAGE显示两种蛋白在同一个峰里)。 现在我考虑的是两种方法: 1. 提高tev酶的活性，将原蛋白尽量全部酶切，只剩下目标蛋白和切下来的his标签，这样就能分离出目标蛋白。但尝试很多条件都无法达到，总是剩下大概一半的蛋白切不动。 2. 添加一些试剂破坏原蛋白和目标蛋白的相互作用。我的蛋白里有很多二硫键，所以试过GSH和GSSG，但没有用。 大家有没有什么好方法呢？ @飞约疯人院 @wizardfan @biostar2009 发自小木虫Android客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有164人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
化工申博
已经有3人回复
-
申博自荐
已经有3人回复
-
广西民族大学化学化工学院化学工程与技术学硕，材料化工专硕调剂名额充足！
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
2楼2021-01-25 22:30:54
snoopyzxx
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 4
- 应助: 49 (小学生)
- 金币: 2996.1
- 散金: 1276
- 红花: 43
- 帖子: 2258
- 在线: 277.2小时
- 虫号: 548497
- 注册: 2008-04-19
- 性别: MM
- 专业: 全球变化生态学
3楼2021-01-26 07:24:28
snoopyzxx
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 4
- 应助: 49 (小学生)
- 金币: 2996.1
- 散金: 1276
- 红花: 43
- 帖子: 2258
- 在线: 277.2小时
- 虫号: 548497
- 注册: 2008-04-19
- 性别: MM
- 专业: 全球变化生态学
4楼2021-01-26 07:25:37
lostunit
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 58.2
- 散金: 140
- 帖子: 58
- 在线: 18.5小时
- 虫号: 19696490
- 注册: 2019-11-12
- 专业: 食品科学基础
5楼2021-01-26 08:30:00
lostunit
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 58.2
- 散金: 140
- 帖子: 58
- 在线: 18.5小时
- 虫号: 19696490
- 注册: 2019-11-12
- 专业: 食品科学基础
6楼2021-01-26 08:32:36
snoopyzxx
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 4
- 应助: 49 (小学生)
- 金币: 2996.1
- 散金: 1276
- 红花: 43
- 帖子: 2258
- 在线: 277.2小时
- 虫号: 548497
- 注册: 2008-04-19
- 性别: MM
- 专业: 全球变化生态学
7楼2021-01-26 09:12:55
8楼2021-01-27 09:12:18
heroxuning
木虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 1798.3
- 红花: 5
- 帖子: 391
- 在线: 972小时
- 虫号: 872465
- 注册: 2009-10-14
- 性别: GG
- 专业: 蛋白质组学
9楼2021-01-27 16:07:00
zsygxh
金虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 1110.3
- 散金: 11
- 红花: 2
- 帖子: 105
- 在线: 56.5小时
- 虫号: 2821684
- 注册: 2013-11-23
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
|
1. Cys多，形成分子间聚集体。验证：还原非还原电泳，一份样品Loading Buffer加还原剂，另一方样品不加，电泳比较是否形成二硫键聚集体。是的话加还原剂，如β-ME，DTT，TCEP，加之前确认一下填料对不同还原剂的耐受量，不同填料差异是比较大的。 2. Cys的巯基也是可以和Ni填料结合的，但作用力弱于His，如果有多个Cys，His或其它能结合的氨基酸侧链在空间上比较接近，就容易结合填料，一般的处理方法是加低浓度的咪唑来竞争结合。Cys多的话，还原剂也加上。 3. 不知道你用的是哪种Ni填料，但通常使用的多是羧酸类配基的填料，也就会存在一定的离子相互作用，Ni填料的使用一般要求盐浓度最好在300mM NaCl以上，可以降低蛋白与填料间，以及蛋白分子间的静电吸引力。对于带异种电荷残基比较多的蛋白，盐浓度最好再高点。 4. 酶切切不完全，如果酶本身没有问题，酶切体系也没问题，那么就是蛋白的问题，多半是蛋白的酶切位点没有较好地暴露出来。如果不考虑酶切位点被部分折叠进了蛋白内部的情况，多半是蛋白分子间形成了可溶性聚集体，导致部分位于聚集体表层的蛋白的酶切位点可以被识别，而在聚集体内部的酶切位点无法暴露切割。可能是原因：如果是疏水作用主导的聚集，大概率会形成更大的包涵体沉淀，所以我个人更倾向于认为是二硫键错配交联或二硫键错配与静电吸引力共同主导的聚集。如果是前者，在酶切时还是加足够的还原剂，如果是后者就需要补加足够的盐（但TEV的酶活受盐浓度影响）。如果是我，我会把TEV酶切位点改掉，比如换成更好用的3C位点或者sumo标签。万一疏水作用比较明显，可以加低浓度的尿素或盐酸胍来竞争氢键。 |
10楼2021-01-28 15:01:32
