2kb片段插入总是失败，搞了半年了，求前辈拯救 - 分子生物 - DNA重组

11楼2020-01-05 10:19:29

coostudent

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10楼: Originally posted by tenghaiyan at 2020-01-05 07:54:04
有些片段做菌液PCR未必能扩到，我曾经被困扰半年才发现

我遇到过一次情况是菌液p出了正确条带，提质粒后验证又没了
不过验证方法这块我还真没考虑过，我下次提质粒验证试试，多谢指点！

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12楼2020-01-05 10:23:29

liling0601

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7楼: Originally posted by coostudent at 2020-01-03 14:48:36
in-fusion做了几次都失败了，最后转化涂板后在相应抗性环境下都能生长，应该是片段没插进去，最后载体自连，就是搞不懂为什么会自连的这么彻底
质粒10kb左右大小，pcr的话有什么pcr酶推荐么？
多谢答复！...

估计是你酶切的问题，PCR产物是割胶回收的吗？PCR时模板量要少一点，1-10ng,载体酶切之后涂板看看酶切的效果

13楼2020-01-17 15:31:44

匿名

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14楼2020-02-03 13:37:55

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xiaopei子

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载体CIP处理好，重组臂看能不能设长一点；单酶切还是有风险，如果实在没合适的酶那也没办法了，多筛选一些，只要基因没有毒性，就用和载体适配的感受态应该没有问题的。

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15楼2020-02-06 21:11:25

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Xba I容易被甲基化，换个宿主，去甲基化后再切试试

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16楼2020-02-08 11:42:45

MerlingMay

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你好，楼主，问题解决了么？我现在也在用in fusion克隆，其中一个把1.6kb的片段重组到3.6kb的载体上没问题，但是6kb的片段重组到载体上就有问题，平板上都是假阳性，酶切验证之后都是杂带。你有什么建议么？？？

17楼2020-05-04 17:20:00