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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 2kb片段插入总是失败，搞了半年了，求前辈拯救
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coostudent

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
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9楼: Originally posted by KM石头 at 2020-01-04 19:22:33
楼主可以考虑换一种大肠杆菌感受态细胞，我构建过一种载体质粒，只有xl_blue好用，其他DH5a，jm109都不好使，楼主可以试试看，可能有用

好的 谢谢

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11楼2020-01-05 10:19:29
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coostudent

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
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10楼: Originally posted by tenghaiyan at 2020-01-05 07:54:04
有些片段做菌液PCR未必能扩到，我曾经被困扰半年才发现

我遇到过一次情况是菌液p出了正确条带，提质粒后验证又没了
不过验证方法这块我还真没考虑过，我下次提质粒验证试试，多谢指点！

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12楼2020-01-05 10:23:29
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liling0601

铜虫 (小有名气)
★
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7楼: Originally posted by coostudent at 2020-01-03 14:48:36
in-fusion做了几次都失败了，最后转化涂板后在相应抗性环境下都能生长，应该是片段没插进去，最后载体自连，就是搞不懂为什么会自连的这么彻底
质粒10kb左右大小，pcr的话有什么pcr酶推荐么？
多谢答复！...

估计是你酶切的问题，PCR产物是割胶回收的吗？PCR时模板量要少一点，1-10ng,载体酶切之后涂板看看酶切的效果
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13楼2020-01-17 15:31:44
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匿名

用户注销 (著名写手)
★
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14楼2020-02-03 13:37:55
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xiaopei子

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
载体CIP处理好，重组臂看能不能设长一点；单酶切还是有风险，如果实在没合适的酶那也没办法了，多筛选一些，只要基因没有毒性，就用和载体适配的感受态应该没有问题的。

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15楼2020-02-06 21:11:25
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Neo2000

木虫 (著名写手)
Xba I容易被甲基化，换个宿主，去甲基化后再切试试

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16楼2020-02-08 11:42:45
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MerlingMay

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送红花一朵
你好，楼主，问题解决了么？我现在也在用in fusion克隆，其中一个把1.6kb的片段重组到3.6kb的载体上没问题，但是6kb的片段重组到载体上就有问题，平板上都是假阳性，酶切验证之后都是杂带。你有什么建议么？？？
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17楼2020-05-04 17:20:00
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coostudent

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by MerlingMay at 2020-05-04 17:20:00
你好，楼主，问题解决了么？我现在也在用in fusion克隆，其中一个把1.6kb的片段重组到3.6kb的载体上没问题，但是6kb的片段重组到载体上就有问题，平板上都是假阳性，酶切验证之后都是杂带。你有什么建议么？？？

之前的载体构建实验我暂时搁置了
不知你遇到的困难解决了没？
作为新手，我也提不出什么具体的建议……我知道的就是连接时载体和片段的比例，in-fusion同源部分的tm值最好相近，还有就是你酶切验证时提的质粒是不是有污染，导致切出来的可能不止你的质粒片段。
加油吧，共勉！
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18楼2020-05-25 11:19:32
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lqbzfun

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1、选择蓝光切胶。
2、不电泳直接回收
3、总之，避免紫外照射，若没法避免，那就试试提高波长、降低强度、缩短切胶时间
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19楼2020-12-03 11:44:28
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junjieshao

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
20楼2020-12-04 03:00:36
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