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coostudent

铜虫 (小有名气)

送红花一朵
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9楼: Originally posted by KM石头 at 2020-01-04 19:22:33
楼主可以考虑换一种大肠杆菌感受态细胞,我构建过一种载体质粒,只有xl_blue好用,其他DH5a,jm109都不好使,楼主可以试试看,可能有用

好的 谢谢

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11楼2020-01-05 10:19:29
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coostudent

铜虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by tenghaiyan at 2020-01-05 07:54:04
有些片段做菌液PCR未必能扩到,我曾经被困扰半年才发现

我遇到过一次情况是菌液p出了正确条带,提质粒后验证又没了
不过验证方法这块我还真没考虑过,我下次提质粒验证试试,多谢指点!

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12楼2020-01-05 10:23:29
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liling0601

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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7楼: Originally posted by coostudent at 2020-01-03 14:48:36
in-fusion做了几次都失败了,最后转化涂板后在相应抗性环境下都能生长,应该是片段没插进去,最后载体自连,就是搞不懂为什么会自连的这么彻底
质粒10kb左右大小,pcr的话有什么pcr酶推荐么?
多谢答复!...

估计是你酶切的问题,PCR产物是割胶回收的吗?PCR时模板量要少一点,1-10ng,载体酶切之后涂板看看酶切的效果
13楼2020-01-17 15:31:44
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匿名

用户注销 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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14楼2020-02-03 13:37:55
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xiaopei子

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
载体CIP处理好,重组臂看能不能设长一点;单酶切还是有风险,如果实在没合适的酶那也没办法了,多筛选一些,只要基因没有毒性,就用和载体适配的感受态应该没有问题的。

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15楼2020-02-06 21:11:25
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Neo2000

木虫 (著名写手)

Xba I容易被甲基化,换个宿主,去甲基化后再切试试

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16楼2020-02-08 11:42:45
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MerlingMay

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
送红花一朵
你好,楼主,问题解决了么?我现在也在用in fusion克隆,其中一个把1.6kb的片段重组到3.6kb的载体上没问题,但是6kb的片段重组到载体上就有问题,平板上都是假阳性,酶切验证之后都是杂带。你有什么建议么???
17楼2020-05-04 17:20:00
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coostudent

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
17楼: Originally posted by MerlingMay at 2020-05-04 17:20:00
你好,楼主,问题解决了么?我现在也在用in fusion克隆,其中一个把1.6kb的片段重组到3.6kb的载体上没问题,但是6kb的片段重组到载体上就有问题,平板上都是假阳性,酶切验证之后都是杂带。你有什么建议么???

之前的载体构建实验我暂时搁置了
不知你遇到的困难解决了没?
作为新手,我也提不出什么具体的建议……我知道的就是连接时载体和片段的比例,in-fusion同源部分的tm值最好相近,还有就是你酶切验证时提的质粒是不是有污染,导致切出来的可能不止你的质粒片段。
加油吧,共勉!
18楼2020-05-25 11:19:32
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lqbzfun

铜虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
1、选择蓝光切胶。
2、不电泳直接回收
3、总之,避免紫外照射,若没法避免,那就试试提高波长、降低强度、缩短切胶时间
19楼2020-12-03 11:44:28
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junjieshao

禁虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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20楼2020-12-04 03:00:36
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