应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 2kb片段插入总是失败，搞了半年了，求前辈拯救
282/3返回列表上一页123下一页
查看: 3732  |  回复: 27
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

coostudent

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by KM石头 at 2020-01-04 19:22:33
楼主可以考虑换一种大肠杆菌感受态细胞，我构建过一种载体质粒，只有xl_blue好用，其他DH5a，jm109都不好使，楼主可以试试看，可能有用

好的 谢谢

发自小木虫IOS客户端
回复此楼
11楼2020-01-05 10:19:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

coostudent

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by tenghaiyan at 2020-01-05 07:54:04
有些片段做菌液PCR未必能扩到，我曾经被困扰半年才发现

我遇到过一次情况是菌液p出了正确条带，提质粒后验证又没了
不过验证方法这块我还真没考虑过，我下次提质粒验证试试，多谢指点！

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
12楼2020-01-05 10:23:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liling0601

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by coostudent at 2020-01-03 14:48:36
in-fusion做了几次都失败了，最后转化涂板后在相应抗性环境下都能生长，应该是片段没插进去，最后载体自连，就是搞不懂为什么会自连的这么彻底
质粒10kb左右大小，pcr的话有什么pcr酶推荐么？
多谢答复！...

估计是你酶切的问题，PCR产物是割胶回收的吗？PCR时模板量要少一点，1-10ng,载体酶切之后涂板看看酶切的效果
赞一下 回复此楼
13楼2020-01-17 15:31:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖仅楼主可见
赞一下
14楼2020-02-03 13:37:55
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

xiaopei子

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
载体CIP处理好，重组臂看能不能设长一点；单酶切还是有风险，如果实在没合适的酶那也没办法了，多筛选一些，只要基因没有毒性，就用和载体适配的感受态应该没有问题的。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
15楼2020-02-06 21:11:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)
Xba I容易被甲基化，换个宿主，去甲基化后再切试试

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
16楼2020-02-08 11:42:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

MerlingMay

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送红花一朵
你好，楼主，问题解决了么？我现在也在用in fusion克隆，其中一个把1.6kb的片段重组到3.6kb的载体上没问题，但是6kb的片段重组到载体上就有问题，平板上都是假阳性，酶切验证之后都是杂带。你有什么建议么？？？
赞一下 回复此楼
17楼2020-05-04 17:20:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

coostudent

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by MerlingMay at 2020-05-04 17:20:00
你好，楼主，问题解决了么？我现在也在用in fusion克隆，其中一个把1.6kb的片段重组到3.6kb的载体上没问题，但是6kb的片段重组到载体上就有问题，平板上都是假阳性，酶切验证之后都是杂带。你有什么建议么？？？

之前的载体构建实验我暂时搁置了
不知你遇到的困难解决了没？
作为新手，我也提不出什么具体的建议……我知道的就是连接时载体和片段的比例，in-fusion同源部分的tm值最好相近，还有就是你酶切验证时提的质粒是不是有污染，导致切出来的可能不止你的质粒片段。
加油吧，共勉！
赞一下 回复此楼
18楼2020-05-25 11:19:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lqbzfun

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1、选择蓝光切胶。
2、不电泳直接回收
3、总之，避免紫外照射，若没法避免，那就试试提高波长、降低强度、缩短切胶时间
赞一下 回复此楼
19楼2020-12-03 11:44:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

junjieshao

禁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
20楼2020-12-04 03:00:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 coostudent 的主题更新
282/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 化工专硕调剂 +3 利好利好. 2026-03-03 6/300 2026-03-03 18:52 by 利好利好.
[考研] 0703化学 学硕 理工科均可 不区分研究方向 总分279求调剂 +3 1一11 2026-03-03 3/150 2026-03-03 18:03 by houyaoxu
[考研] 085602化学工程350，调剂，有没有211的 +5 利好利好. 2026-03-02 9/450 2026-03-03 17:06 by 利好利好.
[考研] 没上岸的看过来 +3 tangxiaotian 2026-03-01 3/150 2026-03-03 12:03 by emokidd
[考研] 材料工程专硕283求调剂 5+8 ，！？ 2026-03-02 10/500 2026-03-03 12:01 by EBSD
[考研] 材料类考研调剂 +6 gemmgemm 2026-03-01 7/350 2026-03-03 11:16 by EBSD
[考研] 324求调剂 +4 wxz2 2026-03-03 5/250 2026-03-03 09:25 by 杨杨杨紫
[考研] 化工京区271求调剂 +7 11ing 2026-03-02 7/350 2026-03-03 07:30 by 利好利好.
[考研] 288求调剂 +3 少71.8 2026-03-02 5/250 2026-03-03 06:01 by tgxtgxtgx9
[考研] 298求调剂 +10 人间唯你是清欢 2026-02-28 14/700 2026-03-02 22:49 by 人间唯你是清欢
[考研] 求调剂 +11 yunziaaaaa 2026-03-01 13/650 2026-03-02 21:59 by sunny81
[考研] 085600求调剂 +4 LRZZZZZZ 2026-03-02 5/250 2026-03-02 20:33 by 云旗yunqi
[考研] 0856材料调剂 +5 沿岸有贝壳OUC 2026-03-02 5/250 2026-03-02 20:31 by hypershenger
[考研] 0854总分272 +3 打小就是老实人 2026-03-02 4/200 2026-03-02 19:49 by 求调剂zz
[考研] 289求调剂 +8 yang婷 2026-03-02 9/450 2026-03-02 19:08 by zhukairuo
[考研] 一志愿东北大学材料专硕328，求调剂 +3 shs1083 2026-03-02 3/150 2026-03-02 17:27 by houyaoxu
[考研] 284求调剂 +10 天下熯 2026-02-28 11/550 2026-03-02 11:03 by 无际的草原
[考研] 一志愿中南大学理学化学 +4 15779376950 2026-03-01 5/250 2026-03-01 19:00 by Fff-1
[考研] 291分工科求调剂 +9 science饿饿 2026-03-01 10/500 2026-03-01 18:55 by 18137688336
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-02-28 7/350 2026-03-01 15:14 by wjLi2017
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭