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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 2kb片段插入总是失败，搞了半年了，求前辈拯救
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coostudent

铜虫 (小有名气)

[交流] 2kb片段插入总是失败，搞了半年了，求前辈拯救

2kb片段插入质粒xbaI位点，酶切酶连还有in-fusion的方法都试过了，但是最终挑不到阳性克隆。搞了半年了，感觉就是个简单的酶切酶连操作，但就是搞不定，心累，想哭，求拯救！
除了质粒，相关的材料都换过了。质粒也对酶切位点周围测了序，没有问题，理论上也不会发生甲基化……
质粒是链霉菌基因编辑的商业化质粒pCRISPomyces-2 酶切位点XbaI
如需更详细线索 我会在后面补充

或者有做过相关试验的小伙伴吗，求指点！
多谢！

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MerlingMay

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1楼 2020-01-02 11:36:31
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ULYSSEESWB

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2020-01-18 20:29:13
in-fusion也失败？设置过阳性对照么？载体自连？试试pcr线性化载体
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coostudent
2楼2020-01-02 13:15:50
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匿名

★
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coostudent
3楼2020-01-02 13:29:17
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狗狗狗尾巴草

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2020-01-18 20:29:22
实在不行试试双酶切吧，我们实验室基本都是双酶切。酶切连接失败我首先会检查扩增片段的引物上是否有相应的酶切位点及保护碱基；其次是质粒上确实具有这两个酶切位点序列（一定要在质粒上搜到相应的序列，有些质粒图谱画的不靠谱）。最后考虑试剂是否过期。祝你好运
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coostudent
4楼2020-01-02 19:49:06
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傲娇小丫头

新虫 (小有名气)
★
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TAKARA的PrimeSTAR 很好用5秒/1Kb
可以采用同源重组
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一万年太久，只争朝夕。。。。。
8楼2020-01-03 15:29:46
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KM石头

金虫 (正式写手)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2020-01-18 20:29:36
楼主可以考虑换一种大肠杆菌感受态细胞，我构建过一种载体质粒，只有xl_blue好用，其他DH5a，jm109都不好使，楼主可以试试看，可能有用

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coostudent
9楼2020-01-04 19:22:33
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tenghaiyan

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有些片段做菌液PCR未必能扩到，我曾经被困扰半年才发现

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coostudent
10楼2020-01-05 07:54:04
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普通回帖

coostudent

铜虫 (小有名气)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by 龙腾92 at 2020-01-02 13:29:17
单酶切载体有去磷酸化吗？

有试过去磷酸化处理，结果仍然失败……
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5楼2020-01-03 14:45:04
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coostudent

铜虫 (小有名气)
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引用回帖:
4楼: Originally posted by 狗狗狗尾巴草 at 2020-01-02 19:49:06
实在不行试试双酶切吧，我们实验室基本都是双酶切。酶切连接失败我首先会检查扩增片段的引物上是否有相应的酶切位点及保护碱基；其次是质粒上确实具有这两个酶切位点序列（一定要在质粒上搜到相应的序列，有些质粒图 ...

嗯，好的，我去试着找找有没有其他合适的酶切位点。
多谢指点！
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6楼2020-01-03 14:45:44
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coostudent

铜虫 (小有名气)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by ULYSSEESWB at 2020-01-02 13:15:50
in-fusion也失败？设置过阳性对照么？载体自连？试试pcr线性化载体

in-fusion做了几次都失败了，最后转化涂板后在相应抗性环境下都能生长，应该是片段没插进去，最后载体自连，就是搞不懂为什么会自连的这么彻底
质粒10kb左右大小，pcr的话有什么pcr酶推荐么？
多谢答复！
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7楼2020-01-03 14:48:36
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