| 查看: 3948 | 回复: 27 | |||
coostudent铜虫 (小有名气)
|
[交流]
2kb片段插入总是失败，搞了半年了，求前辈拯救
|
||
|
2kb片段插入质粒xbaI位点，酶切酶连还有in-fusion的方法都试过了，但是最终挑不到阳性克隆。搞了半年了，感觉就是个简单的酶切酶连操作，但就是搞不定，心累，想哭，求拯救！ 除了质粒，相关的材料都换过了。质粒也对酶切位点周围测了序，没有问题，理论上也不会发生甲基化…… 质粒是链霉菌基因编辑的商业化质粒pCRISPomyces-2 酶切位点XbaI 如需更详细线索 我会在后面补充 或者有做过相关试验的小伙伴吗，求指点！ 多谢！ 发自小木虫IOS客户端 |
回复此楼» 本帖已获得的红花（最新10朵）
MerlingMay» 猜你喜欢
依喜替康：新型喜树碱衍生物的研究进展
已经有1人回复
-
膀胱癌靶向治疗新选择：厄达替尼作用机制与耐药研究进展
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有116人回复
-
从水母到实验室：腔肠素的发现历程与生物发光奥秘
已经有1人回复
-
线粒体氧化磷酸化的新靶点：S-Gboxin的发现与研究进展
已经有0人回复
-
PROTAC药物开发选择VHL配体：MDK-7526以87%出口向量占有率成首选
已经有0人回复
-
MCC950：NLRP3炎症小体特异性抑制剂的科研应用与前景
已经有0人回复
-
康替唑胺研发17年：如何解决多重耐药菌感染难题
已经有0人回复
-
伊曲莫德（Etrasimod）从“肠道免疫失控”到精准靶向干预
已经有1人回复
-
西达本胺：创新HDAC抑制剂的抗肿瘤之路
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
ULYSSEESWB
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 39 (小学生)
- 金币: 7653.9
- 散金: 2508
- 红花: 7
- 帖子: 596
- 在线: 1095.6小时
- 虫号: 939000
- 注册: 2010-01-08
- 专业: 药理学其他科学问题
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2020-01-18 20:29:13
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2020-01-18 20:29:13
| in-fusion也失败？设置过阳性对照么？载体自连？试试pcr线性化载体 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
2楼2020-01-02 13:15:50
3楼2020-01-02 13:29:17
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2020-01-18 20:29:22
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2020-01-18 20:29:22
| 实在不行试试双酶切吧，我们实验室基本都是双酶切。酶切连接失败我首先会检查扩增片段的引物上是否有相应的酶切位点及保护碱基；其次是质粒上确实具有这两个酶切位点序列（一定要在质粒上搜到相应的序列，有些质粒图谱画的不靠谱）。最后考虑试剂是否过期。祝你好运 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
4楼2020-01-02 19:49:06
8楼2020-01-03 15:29:46
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2020-01-18 20:29:36
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2020-01-18 20:29:36
|
楼主可以考虑换一种大肠杆菌感受态细胞，我构建过一种载体质粒，只有xl_blue好用，其他DH5a，jm109都不好使，楼主可以试试看，可能有用 发自小木虫Android客户端 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
9楼2020-01-04 19:22:33
10楼2020-01-05 07:54:04
coostudent
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 17.7
- 散金: 227
- 红花: 1
- 帖子: 210
- 在线: 98小时
- 虫号: 3518096
- 注册: 2014-11-04
- 专业: 天然有机化学
5楼2020-01-03 14:45:04
coostudent
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 17.7
- 散金: 227
- 红花: 1
- 帖子: 210
- 在线: 98小时
- 虫号: 3518096
- 注册: 2014-11-04
- 专业: 天然有机化学
6楼2020-01-03 14:45:44
coostudent
铜虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 17.7
- 散金: 227
- 红花: 1
- 帖子: 210
- 在线: 98小时
- 虫号: 3518096
- 注册: 2014-11-04
- 专业: 天然有机化学
7楼2020-01-03 14:48:36