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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 2kb片段插入总是失败，搞了半年了，求前辈拯救
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youxistar

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我最近用的in-fusion克隆，菌落PCR出来是阳性条带，送测序全部是载体序列。。。困扰中。片段是切胶回收的，也不大，500bp
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21楼2021-02-02 17:42:23
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youxistar

金虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by lqbzfun at 2020-12-03 11:44:28
1、选择蓝光切胶。
2、不电泳直接回收
3、总之，避免紫外照射，若没法避免，那就试试提高波长、降低强度、缩短切胶时间

您好，请问不电泳怎么能够直接回收呢？
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22楼2021-02-02 17:43:34
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dadaoxing

禁虫 (著名写手)
★
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本帖内容被屏蔽
23楼2021-02-02 19:35:34
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
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要不要我给你试试？

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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
24楼2021-02-02 20:15:25
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fengxueren

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议先确认PCR模板是否有问题，引物是否正确

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25楼2021-02-18 00:27:08
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wenting8918

木虫 (正式写手)

小硕
★
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引用回帖:
9楼: Originally posted by KM石头 at 2020-01-04 14:22:33
楼主可以考虑换一种大肠杆菌感受态细胞，我构建过一种载体质粒，只有xl_blue好用，其他DH5a，jm109都不好使，楼主可以试试看，可能有用

不知道你是哪种载体要  xl_blue ？
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永远幸福，幸福永远
26楼2021-02-20 15:17:06
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HK驱魔者

铁虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
7楼: Originally posted by coostudent at 2020-01-03 14:48:36
in-fusion做了几次都失败了，最后转化涂板后在相应抗性环境下都能生长，应该是片段没插进去，最后载体自连，就是搞不懂为什么会自连的这么彻底
质粒10kb左右大小，pcr的话有什么pcr酶推荐么？
多谢答复！...

楼主连上了吗？我之前也总是载体自连，我是用双酶切，后来发现连接酶效率不行了，换了个酶就没问题了

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27楼2021-03-20 22:43:14
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xhl1024

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我可以求一个pCRISPomyces-2商业质粒嘛，谢谢楼主！
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28楼2021-11-04 15:24:36
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