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coostudent

铜虫 (小有名气)

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[交流] 2kb片段插入总是失败，搞了半年了，求前辈拯救

2kb片段插入质粒xbaI位点，酶切酶连还有in-fusion的方法都试过了，但是最终挑不到阳性克隆。搞了半年了，感觉就是个简单的酶切酶连操作，但就是搞不定，心累，想哭，求拯救！
除了质粒，相关的材料都换过了。质粒也对酶切位点周围测了序，没有问题，理论上也不会发生甲基化……
质粒是链霉菌基因编辑的商业化质粒pCRISPomyces-2 酶切位点XbaI
如需更详细线索我会在后面补充

或者有做过相关试验的小伙伴吗，求指点！
多谢！

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MerlingMay

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1楼 2020-01-02 11:36:31

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liling0601

铜虫 (小有名气)

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引用回帖:

7楼: Originally posted by coostudent at 2020-01-03 14:48:36
in-fusion做了几次都失败了，最后转化涂板后在相应抗性环境下都能生长，应该是片段没插进去，最后载体自连，就是搞不懂为什么会自连的这么彻底
质粒10kb左右大小，pcr的话有什么pcr酶推荐么？
多谢答复！...

估计是你酶切的问题，PCR产物是割胶回收的吗？PCR时模板量要少一点，1-10ng,载体酶切之后涂板看看酶切的效果