| 查看: 2761 | 回复: 20 | |||
[交流]
双交换问题
|
|||
| 最近在做pre112自杀质粒大肠杆菌基因敲除 单交换已经做出来了 pcr2条带 大小也对 现在在10%蔗糖作用下双交换筛选 已经培养了7代了 大概有50%几率出现疑似阳性菌 挑了几十个疑似阳性菌pcr验证结果全是野生型，求大佬指点一下怎么破 就只能一个个筛选 靠工作量选吗 有什么技巧吗 有点难受啊 |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有180人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
辽石化新材料学院材料专业调剂 理转工 / 学专互调
+1/490
-
2026年一战成硕的绝佳机会，青岛农大草业学院仍有大量调剂名额
+2/242
-
桂林理工大学物理学专业招收调剂
+1/189
-
★★爆★★0860生物与医药调剂考生看过来，河北大学化学与材料科学学院
+2/128
-
武汉工程大学联合培养招收硕士（食品、环境和化学相关专业）
+1/90
-
上海交通大学-宁波东方理工大学联培博士2026年秋季招生
+1/89
-
攀枝花学院大量招收调剂：材料科学与工程(学硕：0805)和材料工程（专硕：0856）
+1/53
-
西安交通大学陕西省科技创新团队常年招聘保送生和考研生，每年2-4个名额
+1/41
-
2026年盐城工学院化学工程与技术专业（学硕）招收08所有专业和0703方向考生
+1/40
-
大湾区大学李红庚与中国科学技术大学王柳教授联合招收博士后
+1/39
-
佛山大学 动物科技学院 畜牧 欢迎广大学子报考！
+1/15
-
湖南师范大学药物分析学2026年硕士研究生调剂
+1/11
-
南华大学资源环境专硕和环境科学与工程学硕有调剂名额
+1/10
-
太原科技大学光学工程、光电信息工程接受调剂
+1/8
-
河南师大全国重点实验室—0780药学、08600生物与医药仍有调剂指标！
+1/8
-
滁州学院生物与医药专硕接收调剂，名额多多！
+1/7
-
中国科学院城市环境研究所与福建农林大学联合培养研究生调剂公告（第一批）
+1/5
-
华北理工大学矿物加工工程方向接收调剂研究生
+1/4
-
哈尔滨医科大学李老师课题组招收生物信息学方向博士、硕士研究生
+1/4
-
大连工业大学纺织与材料工程学院超临界流体技术课题组 研究生调剂
+1/4
5楼2019-12-06 06:20:00
9楼2019-12-06 08:43:51
10楼2019-12-06 09:00:56
11楼2019-12-06 11:35:44
17楼2020-06-24 15:57:52
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
|
同学你好，我最近也在用pre112自杀质粒做基因敲除 ，单交换我只能扩出一条带，还有就是蔗糖诱导丢失后的几百个单菌落都有氯霉素抗性，可以给我点建议吗？万分感谢！ 发自小木虫Android客户端 |
18楼2021-11-12 00:40:30
19楼2023-03-24 00:01:26
你好，请问该问题解决了吗？求教一下有什么方法吗20楼2025-05-22 16:25:53
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
|
1. 验证sacB系统的有效性 原理：sacB基因在蔗糖存在时表达果聚糖蔗糖酶，产生对大肠杆菌有毒的果聚糖。只有发生双交换（丢失sacB）的菌才能存活。 实验验证： 将单交换菌（含sacB）涂布到含10%蔗糖的平板上，同时设置不含蔗糖的对照。 如果单交换菌在蔗糖平板上无法生长，说明sacB系统正常；若生长良好，则sacB可能失效（需检查质粒构建或培养条件）。 2. 优化双交换筛选条件 蔗糖浓度与传代次数： 确认文献中推荐的蔗糖浓度（通常为5-10%），可尝试提高浓度至10%-15%以增强选择压力。 延长传代时间至10代以上，确保质粒完全丢失。 液体富集法： 在液体培养基中进行多次传代（含蔗糖、无抗性），富集双交换菌后再涂板，提高阳性克隆比例。 3. 检查PCR验证方法 引物设计： 设计两对引物：外侧引物（同源臂外侧）和内侧引物（靶基因内部），确保双交换后扩增出预期条带（如靶基因缺失）。 示例：野生型扩增长度较大，双交换后片段缩短（或反之）。 对照设置： 使用野生型和单交换菌作为对照，确认PCR区分能力。 测序验证： 对部分PCR产物测序，确认是否发生预期重组。 4. 排除抗性干扰 确保双交换筛选过程中完全去除抗生素，避免残留抗性导致未丢失质粒的菌生长。 5. 提高双交换效率 同源臂长度优化： 确保同源臂足够长（通常500-1000 bp），短于200 bp可能导致重组效率低下。 使用重组增强菌株： 采用表达λ Red重组酶（如BW25113/pKD46）的菌株，提高同源重组效率。 温度诱导： 若使用温度敏感型质粒，调整培养温度（如30℃→42℃）诱导质粒丢失。 6. 排除回复突变或污染 严格无菌操作： 避免野生型菌污染，尤其在传代过程中。 表型验证： 结合靶基因功能（如抗性丢失、代谢缺陷）进行表型验证（如药敏试验）。 7. 尝试替代筛选策略 双重筛选标记： 使用sacB联合其他负筛选标记（如rpsL、ccdB）提高筛选特异性。 抗生素梯度平板： 结合抗生素浓度梯度，筛选完全丢失质粒的菌落。 总结建议 优先验证sacB系统，确认蔗糖筛选条件有效。 优化PCR引物设计，确保能区分双交换与野生型。 延长传代次数至10代以上，结合液体富集提高阳性率。 若问题持续，考虑更换同源臂或使用重组增强菌株。 通过系统排查和优化，可显著提高双交换筛选成功率，减少无效工作量的消耗。如果仍无进展，建议查阅相关文献（如Datsenko & Wanner, 2000）或咨询实验室前辈获取经验参数。 |
21楼2025-05-26 14:38:05
简单回复
2019-12-06 02:22
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
nono20093楼
2019-12-06 02:51
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
tzynew4楼
2019-12-06 05:52
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
2019-12-06 07:58
回复
2019-12-06 08:03
回复
2019-12-06 08:13
回复
psylhh12楼
2019-12-06 21:20
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
xiaoqiuqiu2013楼
2019-12-06 23:12
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
syhorchid14楼
2019-12-06 23:23
回复
miaojiabing15楼
2019-12-09 08:18
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
xydlengyue16楼
2019-12-09 21:12
回复
=。=
