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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 双交换问题
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xydlengyue

金虫 (正式写手)

[交流] 双交换问题

最近在做pre112自杀质粒大肠杆菌基因敲除  单交换已经做出来了 pcr2条带 大小也对 现在在10%蔗糖作用下双交换筛选 已经培养了7代了 大概有50%几率出现疑似阳性菌 挑了几十个疑似阳性菌pcr验证结果全是野生型，求大佬指点一下怎么破  就只能一个个筛选  靠工作量选吗  有什么技巧吗  有点难受啊
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1楼 2019-12-06 00:53:52
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liuqiang68

至尊木虫 (文坛精英)
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
加油

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5楼2019-12-06 06:20:00
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
做大肠敲除，不用Red系统和CRISPR系统，用SacB系统，效率很低

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9楼2019-12-06 08:43:51
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by biosci at 2019-12-06 08:43:51
做大肠敲除，不用Red系统和CRISPR系统，用SacB系统，效率很低

但是已经到了最后一步了..

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10楼2019-12-06 09:00:56
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liuqiang68 at 2019-12-06 06:20:00
加油

谢谢
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11楼2019-12-06 11:35:44
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喵咪在哪

新虫 (小有名气)
要不提高下蔗糖浓度，我们实验室用的都是20%蔗糖。

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17楼2020-06-24 15:57:52
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十方羽

新虫 (初入文坛)
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
同学你好，我最近也在用pre112自杀质粒做基因敲除 ，单交换我只能扩出一条带，还有就是蔗糖诱导丢失后的几百个单菌落都有氯霉素抗性，可以给我点建议吗？万分感谢！

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18楼2021-11-12 00:40:30
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chenhuale

铜虫 (小有名气)
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
请问第二次同源重组（双交换）只能用蔗糖压力吗？像温敏的自杀质粒，能用高温来筛二次重组吗？

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19楼2023-03-24 00:01:26
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清醒的瞌睡虫

新虫 (小有名气)
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
你好，请问该问题解决了吗？求教一下有什么方法吗
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20楼2025-05-22 16:25:53
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1420488582

新虫 (初入文坛)
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
1. 验证sacB系统的有效性
原理：sacB基因在蔗糖存在时表达果聚糖蔗糖酶，产生对大肠杆菌有毒的果聚糖。只有发生双交换（丢失sacB）的菌才能存活。

实验验证：

将单交换菌（含sacB）涂布到含10%蔗糖的平板上，同时设置不含蔗糖的对照。

如果单交换菌在蔗糖平板上无法生长，说明sacB系统正常；若生长良好，则sacB可能失效（需检查质粒构建或培养条件）。

2. 优化双交换筛选条件
蔗糖浓度与传代次数：

确认文献中推荐的蔗糖浓度（通常为5-10%），可尝试提高浓度至10%-15%以增强选择压力。

延长传代时间至10代以上，确保质粒完全丢失。

液体富集法：

在液体培养基中进行多次传代（含蔗糖、无抗性），富集双交换菌后再涂板，提高阳性克隆比例。

3. 检查PCR验证方法
引物设计：

设计两对引物：外侧引物（同源臂外侧）和内侧引物（靶基因内部），确保双交换后扩增出预期条带（如靶基因缺失）。

示例：野生型扩增长度较大，双交换后片段缩短（或反之）。

对照设置：

使用野生型和单交换菌作为对照，确认PCR区分能力。

测序验证：

对部分PCR产物测序，确认是否发生预期重组。

4. 排除抗性干扰
确保双交换筛选过程中完全去除抗生素，避免残留抗性导致未丢失质粒的菌生长。

5. 提高双交换效率
同源臂长度优化：

确保同源臂足够长（通常500-1000 bp），短于200 bp可能导致重组效率低下。

使用重组增强菌株：

采用表达λ Red重组酶（如BW25113/pKD46）的菌株，提高同源重组效率。

温度诱导：

若使用温度敏感型质粒，调整培养温度（如30℃→42℃）诱导质粒丢失。

6. 排除回复突变或污染
严格无菌操作：

避免野生型菌污染，尤其在传代过程中。

表型验证：

结合靶基因功能（如抗性丢失、代谢缺陷）进行表型验证（如药敏试验）。

7. 尝试替代筛选策略
双重筛选标记：

使用sacB联合其他负筛选标记（如rpsL、ccdB）提高筛选特异性。

抗生素梯度平板：

结合抗生素浓度梯度，筛选完全丢失质粒的菌落。

总结建议
优先验证sacB系统，确认蔗糖筛选条件有效。

优化PCR引物设计，确保能区分双交换与野生型。

延长传代次数至10代以上，结合液体富集提高阳性率。

若问题持续，考虑更换同源臂或使用重组增强菌株。

通过系统排查和优化，可显著提高双交换筛选成功率，减少无效工作量的消耗。如果仍无进展，建议查阅相关文献（如Datsenko & Wanner, 2000）或咨询实验室前辈获取经验参数。
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21楼2025-05-26 14:38:05
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syhorchid2楼
2019-12-06 02:22   回复  
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nono20093楼
2019-12-06 02:51   回复  
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tzynew4楼
2019-12-06 05:52   回复  
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xiaoshuang16楼
2019-12-06 07:58   回复  
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solarzhao7楼
2019-12-06 08:03   回复  
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hikingman8楼
2019-12-06 08:13   回复  
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psylhh12楼
2019-12-06 21:20   回复  
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xiaoqiuqiu2013楼
2019-12-06 23:12   回复  
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syhorchid14楼
2019-12-06 23:23   回复  
miaojiabing15楼
2019-12-09 08:18   回复  
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xydlengyue16楼
2019-12-09 21:12   回复  
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