| 查看: 2304 | 回复: 20 | |||
[交流]
双交换问题
|
|||
| 最近在做pre112自杀质粒大肠杆菌基因敲除 单交换已经做出来了 pcr2条带 大小也对 现在在10%蔗糖作用下双交换筛选 已经培养了7代了 大概有50%几率出现疑似阳性菌 挑了几十个疑似阳性菌pcr验证结果全是野生型，求大佬指点一下怎么破 就只能一个个筛选 靠工作量选吗 有什么技巧吗 有点难受啊 |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有78人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
坐标武汉，征友
+2/238
-
真诚脱单
+1/77
-
中国科学院深圳先进技术研究院余敏课题组招聘研究助理
+5/60
-
燕山大学2026级考核制博士招生——电容去离子方向（超级电容器衍生应用）
+1/38
-
2026博士申请-药物化学方向（小分子化合物合成）
+1/32
-
【宁德时代招聘】电化学科学家
+1/28
-
浙大城市学院向铮教授与浙江大学联合招聘博后
+1/27
-
现代材料与先进制造团队硕士生、博士生以及博士毕业生招收公告
+1/9
-
诚招博士后及研究人员
+1/9
-
美国圣母大学张艳良教授诚招全奖博士生
+2/8
-
浙江大学-化工学院刘平伟课题组-二维材料/功能聚合物开发
+1/6
-
北京理工大学飞行机器人研究团队招聘2026届博士生
+1/5
-
福建师范大学 国家级人才团队 电池回收方向 招收2026年入学博士
+1/4
-
长江大学武汉校区诚招新能源博士-2025
+1/4
-
澳洲皇家墨尔本理工RMIT招收网安方向CSC PhD
+1/4
-
大连海事大学国家级人才团队2026年博士研究生招生启事
+1/4
-
沙特法赫德国王石油与矿产大学（KFUPM）膜分离课题组招生
+1/3
-
同济大学高绍荣院士王冕课题组诚聘博士后
+1/3
-
东莞理工学院-大连化物所联合招聘光催化方向博士后2名（年薪48W）
+1/3
-
湘潭大学沈志刚教授课题组欢迎博士生报考，博士后加盟
+1/1
5楼2019-12-06 06:20:00
9楼2019-12-06 08:43:51
10楼2019-12-06 09:00:56
11楼2019-12-06 11:35:44
17楼2020-06-24 15:57:52
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
|
同学你好，我最近也在用pre112自杀质粒做基因敲除 ，单交换我只能扩出一条带，还有就是蔗糖诱导丢失后的几百个单菌落都有氯霉素抗性，可以给我点建议吗？万分感谢！ 发自小木虫Android客户端 |
18楼2021-11-12 00:40:30
19楼2023-03-24 00:01:26
你好，请问该问题解决了吗？求教一下有什么方法吗20楼2025-05-22 16:25:53
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
|
1. 验证sacB系统的有效性 原理：sacB基因在蔗糖存在时表达果聚糖蔗糖酶，产生对大肠杆菌有毒的果聚糖。只有发生双交换（丢失sacB）的菌才能存活。 实验验证： 将单交换菌（含sacB）涂布到含10%蔗糖的平板上，同时设置不含蔗糖的对照。 如果单交换菌在蔗糖平板上无法生长，说明sacB系统正常；若生长良好，则sacB可能失效（需检查质粒构建或培养条件）。 2. 优化双交换筛选条件 蔗糖浓度与传代次数： 确认文献中推荐的蔗糖浓度（通常为5-10%），可尝试提高浓度至10%-15%以增强选择压力。 延长传代时间至10代以上，确保质粒完全丢失。 液体富集法： 在液体培养基中进行多次传代（含蔗糖、无抗性），富集双交换菌后再涂板，提高阳性克隆比例。 3. 检查PCR验证方法 引物设计： 设计两对引物：外侧引物（同源臂外侧）和内侧引物（靶基因内部），确保双交换后扩增出预期条带（如靶基因缺失）。 示例：野生型扩增长度较大，双交换后片段缩短（或反之）。 对照设置： 使用野生型和单交换菌作为对照，确认PCR区分能力。 测序验证： 对部分PCR产物测序，确认是否发生预期重组。 4. 排除抗性干扰 确保双交换筛选过程中完全去除抗生素，避免残留抗性导致未丢失质粒的菌生长。 5. 提高双交换效率 同源臂长度优化： 确保同源臂足够长（通常500-1000 bp），短于200 bp可能导致重组效率低下。 使用重组增强菌株： 采用表达λ Red重组酶（如BW25113/pKD46）的菌株，提高同源重组效率。 温度诱导： 若使用温度敏感型质粒，调整培养温度（如30℃→42℃）诱导质粒丢失。 6. 排除回复突变或污染 严格无菌操作： 避免野生型菌污染，尤其在传代过程中。 表型验证： 结合靶基因功能（如抗性丢失、代谢缺陷）进行表型验证（如药敏试验）。 7. 尝试替代筛选策略 双重筛选标记： 使用sacB联合其他负筛选标记（如rpsL、ccdB）提高筛选特异性。 抗生素梯度平板： 结合抗生素浓度梯度，筛选完全丢失质粒的菌落。 总结建议 优先验证sacB系统，确认蔗糖筛选条件有效。 优化PCR引物设计，确保能区分双交换与野生型。 延长传代次数至10代以上，结合液体富集提高阳性率。 若问题持续，考虑更换同源臂或使用重组增强菌株。 通过系统排查和优化，可显著提高双交换筛选成功率，减少无效工作量的消耗。如果仍无进展，建议查阅相关文献（如Datsenko & Wanner, 2000）或咨询实验室前辈获取经验参数。 |
21楼2025-05-26 14:38:05
简单回复
2019-12-06 02:22
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
nono20093楼
2019-12-06 02:51
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
tzynew4楼
2019-12-06 05:52
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
2019-12-06 07:58
回复
2019-12-06 08:03
回复
2019-12-06 08:13
回复
psylhh12楼
2019-12-06 21:20
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
xiaoqiuqiu2013楼
2019-12-06 23:12
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
syhorchid14楼
2019-12-06 23:23
回复
miaojiabing15楼
2019-12-09 08:18
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
xydlengyue16楼
2019-12-09 21:12
回复
=。=