| 查看: 2686 | 回复: 20 | |||
[交流]
双交换问题
|
|||
| 最近在做pre112自杀质粒大肠杆菌基因敲除 单交换已经做出来了 pcr2条带 大小也对 现在在10%蔗糖作用下双交换筛选 已经培养了7代了 大概有50%几率出现疑似阳性菌 挑了几十个疑似阳性菌pcr验证结果全是野生型，求大佬指点一下怎么破 就只能一个个筛选 靠工作量选吗 有什么技巧吗 有点难受啊 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有266人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
香港中文大学（深圳）靳羽华教授交叉实验室招募2026年材料学博士生（光致变色）
+2/160
-
电力全国重点实验室双一流A类长江学者团队招2026年全日制博士1名（4月3日截止）
+2/100
-
南京医科大学生殖医学与子代健康国重实验室-董飞宏课题组-学术硕士招生
+1/93
-
济南大学林秀娟教授招收材料类博士生
+1/83
-
广东工业大学-木质纤维素高值化利用团队招博士研究生
+1/82
-
有没有在香港的虫友啊
+1/72
-
上海交大招聘高分子方向博士后及科研助理
+1/36
-
福建师范大学闽江学者陈巍教授团队招收2026年化学、化工或材料专业的学硕6名
+1/33
-
中山大学院士团队微纳器件、脑机接口方向博士招生、博后招聘
+1/18
-
湖南大学微生物结构与功能实验室2026年计划招收博士研究生
+1/17
-
湖南大学微生物结构与功能实验室2026年计划招收博士研究生
+1/14
-
北京航空航天大学招生微流控与智能打印技术方向博士研究生
+2/8
-
多伦多大学 & Synetic Labs 招博士后/研究员
+1/8
-
【第三轮招生】澳科大诚招2026年秋季药剂学硕士研究生（3月31日下午18:00截止）
+1/5
-
中国农科院兰州牧药所兽药创新与耐药性科研团队聘科研助理，急急急！
+1/5
-
211/双一流石河子大学化学化工学院--电催化，CO2转化
+1/3
-
生物技术工程+326，求调剂！
+1/3
-
Top-88悉尼科技大学数据科学/AI 招收2027年入学 校奖 博士生1到2名(国际和本地学生）
+1/3
-
2026年材料化工专业接受2名硕士研究生调剂
+1/2
-
211/双一流石河子大学化学化工学院-电池/电催化研究方向
+1/1
5楼2019-12-06 06:20:00
9楼2019-12-06 08:43:51
10楼2019-12-06 09:00:56
11楼2019-12-06 11:35:44
17楼2020-06-24 15:57:52
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
|
同学你好，我最近也在用pre112自杀质粒做基因敲除 ，单交换我只能扩出一条带，还有就是蔗糖诱导丢失后的几百个单菌落都有氯霉素抗性，可以给我点建议吗？万分感谢！ 发自小木虫Android客户端 |
18楼2021-11-12 00:40:30
19楼2023-03-24 00:01:26
你好，请问该问题解决了吗？求教一下有什么方法吗20楼2025-05-22 16:25:53
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
|
1. 验证sacB系统的有效性 原理：sacB基因在蔗糖存在时表达果聚糖蔗糖酶，产生对大肠杆菌有毒的果聚糖。只有发生双交换（丢失sacB）的菌才能存活。 实验验证： 将单交换菌（含sacB）涂布到含10%蔗糖的平板上，同时设置不含蔗糖的对照。 如果单交换菌在蔗糖平板上无法生长，说明sacB系统正常；若生长良好，则sacB可能失效（需检查质粒构建或培养条件）。 2. 优化双交换筛选条件 蔗糖浓度与传代次数： 确认文献中推荐的蔗糖浓度（通常为5-10%），可尝试提高浓度至10%-15%以增强选择压力。 延长传代时间至10代以上，确保质粒完全丢失。 液体富集法： 在液体培养基中进行多次传代（含蔗糖、无抗性），富集双交换菌后再涂板，提高阳性克隆比例。 3. 检查PCR验证方法 引物设计： 设计两对引物：外侧引物（同源臂外侧）和内侧引物（靶基因内部），确保双交换后扩增出预期条带（如靶基因缺失）。 示例：野生型扩增长度较大，双交换后片段缩短（或反之）。 对照设置： 使用野生型和单交换菌作为对照，确认PCR区分能力。 测序验证： 对部分PCR产物测序，确认是否发生预期重组。 4. 排除抗性干扰 确保双交换筛选过程中完全去除抗生素，避免残留抗性导致未丢失质粒的菌生长。 5. 提高双交换效率 同源臂长度优化： 确保同源臂足够长（通常500-1000 bp），短于200 bp可能导致重组效率低下。 使用重组增强菌株： 采用表达λ Red重组酶（如BW25113/pKD46）的菌株，提高同源重组效率。 温度诱导： 若使用温度敏感型质粒，调整培养温度（如30℃→42℃）诱导质粒丢失。 6. 排除回复突变或污染 严格无菌操作： 避免野生型菌污染，尤其在传代过程中。 表型验证： 结合靶基因功能（如抗性丢失、代谢缺陷）进行表型验证（如药敏试验）。 7. 尝试替代筛选策略 双重筛选标记： 使用sacB联合其他负筛选标记（如rpsL、ccdB）提高筛选特异性。 抗生素梯度平板： 结合抗生素浓度梯度，筛选完全丢失质粒的菌落。 总结建议 优先验证sacB系统，确认蔗糖筛选条件有效。 优化PCR引物设计，确保能区分双交换与野生型。 延长传代次数至10代以上，结合液体富集提高阳性率。 若问题持续，考虑更换同源臂或使用重组增强菌株。 通过系统排查和优化，可显著提高双交换筛选成功率，减少无效工作量的消耗。如果仍无进展，建议查阅相关文献（如Datsenko & Wanner, 2000）或咨询实验室前辈获取经验参数。 |
21楼2025-05-26 14:38:05
简单回复
2019-12-06 02:22
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
nono20093楼
2019-12-06 02:51
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
tzynew4楼
2019-12-06 05:52
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
2019-12-06 07:58
回复
2019-12-06 08:03
回复
2019-12-06 08:13
回复
psylhh12楼
2019-12-06 21:20
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
xiaoqiuqiu2013楼
2019-12-06 23:12
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
syhorchid14楼
2019-12-06 23:23
回复
miaojiabing15楼
2019-12-09 08:18
回复
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
xydlengyue16楼
2019-12-09 21:12
回复
=。=
