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xydlengyue

金虫 (正式写手)

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[交流] 双交换问题

最近在做pre112自杀质粒大肠杆菌基因敲除单交换已经做出来了 pcr2条带大小也对现在在10%蔗糖作用下双交换筛选已经培养了7代了大概有50%几率出现疑似阳性菌挑了几十个疑似阳性菌pcr验证结果全是野生型，求大佬指点一下怎么破就只能一个个筛选靠工作量选吗有什么技巧吗有点难受啊

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1楼 2019-12-06 00:53:52

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1420488582

新虫 (初入文坛)

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★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与

1. 验证sacB系统的有效性
原理：sacB基因在蔗糖存在时表达果聚糖蔗糖酶，产生对大肠杆菌有毒的果聚糖。只有发生双交换（丢失sacB）的菌才能存活。

实验验证：

将单交换菌（含sacB）涂布到含10%蔗糖的平板上，同时设置不含蔗糖的对照。

如果单交换菌在蔗糖平板上无法生长，说明sacB系统正常；若生长良好，则sacB可能失效（需检查质粒构建或培养条件）。

2. 优化双交换筛选条件
蔗糖浓度与传代次数：

确认文献中推荐的蔗糖浓度（通常为5-10%），可尝试提高浓度至10%-15%以增强选择压力。

延长传代时间至10代以上，确保质粒完全丢失。

液体富集法：

在液体培养基中进行多次传代（含蔗糖、无抗性），富集双交换菌后再涂板，提高阳性克隆比例。

3. 检查PCR验证方法
引物设计：

设计两对引物：外侧引物（同源臂外侧）和内侧引物（靶基因内部），确保双交换后扩增出预期条带（如靶基因缺失）。

示例：野生型扩增长度较大，双交换后片段缩短（或反之）。

对照设置：

使用野生型和单交换菌作为对照，确认PCR区分能力。

测序验证：

对部分PCR产物测序，确认是否发生预期重组。

4. 排除抗性干扰
确保双交换筛选过程中完全去除抗生素，避免残留抗性导致未丢失质粒的菌生长。

5. 提高双交换效率
同源臂长度优化：

确保同源臂足够长（通常500-1000 bp），短于200 bp可能导致重组效率低下。

使用重组增强菌株：

采用表达λ Red重组酶（如BW25113/pKD46）的菌株，提高同源重组效率。

温度诱导：

若使用温度敏感型质粒，调整培养温度（如30℃→42℃）诱导质粒丢失。

6. 排除回复突变或污染
严格无菌操作：

避免野生型菌污染，尤其在传代过程中。

表型验证：

结合靶基因功能（如抗性丢失、代谢缺陷）进行表型验证（如药敏试验）。

7. 尝试替代筛选策略
双重筛选标记：

使用sacB联合其他负筛选标记（如rpsL、ccdB）提高筛选特异性。

抗生素梯度平板：

结合抗生素浓度梯度，筛选完全丢失质粒的菌落。

总结建议
优先验证sacB系统，确认蔗糖筛选条件有效。

优化PCR引物设计，确保能区分双交换与野生型。

延长传代次数至10代以上，结合液体富集提高阳性率。

若问题持续，考虑更换同源臂或使用重组增强菌株。

通过系统排查和优化，可显著提高双交换筛选成功率，减少无效工作量的消耗。如果仍无进展，建议查阅相关文献（如Datsenko & Wanner, 2000）或咨询实验室前辈获取经验参数。