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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 提到的DNA总降解是怎么回事
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jiajiawuwsw

银虫 (小有名气)

[交流] 提到的DNA总降解是怎么回事

我做的是醋酸菌，G-，最近提到的DNA降解特别严重，电泳结果有时候全部是弥散，看不到主带。
我用的方法如下：
收集菌体，加Saline-EDTA buffer(pH8.0),
1. Lysozyme+RNase, 37度,30min；
2.ProteinaseK, 37度，1h;
3.10uL25% SDS， 水浴65度，10min;
4.CTAB, 醋酸钠buffer；
5.氯仿：异戊醇（24：1）抽提两次；
6.冷乙醇沉淀；
7.70%乙醇洗涤一次；
8.干燥，nucleic acid -free water 溶解。

通常在冷乙醇沉淀离心后可以看到明显的白色沉淀，Nano-drop结果也很高，但是电泳结果却是弥散的带。过去，我一直在用这个方法，但最近总是拿不到DNA，酶和试剂也都换了一遍，结果还是不行。

可能我有些重要的细节没有注意好，请各位不吝赐教！
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世界依然美好，值得为之奋斗！
1楼 2009-06-04 00:43:15
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
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换试剂盒试试？gDNA不应该是略弥散的带吗？
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金币是赌出来的
2楼2009-06-04 10:22:52
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jin56419303

木虫 (小有名气)
★
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你说的还是不够详细，具体问题具体分析嘛，方法大致不会有问题，你操作时尽量细致点，不要太剧烈，有一点弥散也是很正常的
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3楼2009-06-04 15:00:52
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)
★
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菌体DNA是有一点分散的，在提取过程中注意动作的强度
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4楼2009-06-04 15:01:21
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琉璃湖畔

木虫 (正式写手)
★
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提取的DNA如果是纯的，应该是透明胶状的吧，怎么是白色的呢？
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淡定淡定，须知努力就好
5楼2009-06-04 15:10:50
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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我个人感觉是消化裂解的时间有点长了
而且整个动作要轻柔，比如混匀是颠转混匀而不能摇动
手提的质量，好的话是可以看到十几二十kb的主带
但是一般来说不需要这么长片段，满足实验即可
另外，试剂盒也很方便啊，国产的就完全满足要求了
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6楼2009-06-04 15:44:22
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weizhenlin

铜虫 (小有名气)
★
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我觉得应该不是操作时动作的问题，蛋白酶K使用时37度是否不太好，这个温度也是DNAase的活性区间，可以尝试提高到60度左右试一下。氯仿抽提时注意颠倒混匀，放在水平摇床上慢摇10分钟，充分变性各种蛋白质。
祝好运！
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7楼2009-06-04 16:27:44
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bbyu007

木虫 (正式写手)
DNA还会降解么。。。没经历过没经验的飘过。。。
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我是笨笨鱼~~~
8楼2009-06-04 16:36:40
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jiajiawuwsw

银虫 (小有名气)
谢谢各位了，提高了ProteinaseK的用温度到60度，同时也缩短了水浴时间，部分菌株可以拿到较好的DNA了。还有一个疑问：在加氯仿抽提的时候，中间变性的蛋白质像是粉末状一样，十分容易被tip吸起，请问这是正常的吗？大家都是如何避免的呢？
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世界依然美好，值得为之奋斗！
9楼2009-06-08 05:09:00
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
建议你就用提植物基因组的CTAB法（65℃，15min之内）试试
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10楼2009-06-08 07:44:53
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