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amilie030312

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
按照常理来讲一般RNA是会降解的,DNA降解的可能性比较小。
11楼2009-06-08 13:09:33
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yierangel

金虫 (小有名气)

检查一下溶解DNA的buffer 的pH是否低于8.0,理论上DNA在pH<8.0时很容易降解。
12楼2009-06-08 18:37:53
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stfo

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
难道是硫修饰????

看看邓院士的文章吧
13楼2009-06-08 21:35:37
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林祎

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
RNA酶有问题吗?操作时剪切力可能有影响
14楼2009-06-09 10:30:49
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jqq1985

银虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
是不是操作太剧烈了?机械性降解DNA?
15楼2009-06-09 12:46:53
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jiajiawuwsw

银虫 (小有名气)

再次求助--好像还是有降解,是不是胶有问题?

按照大家给的提示更改了一些步骤,效果还是不太好. 不知道是不是在提取前就降解了.
世界依然美好,值得为之奋斗!
16楼2009-06-10 16:37:02
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jiajiawuwsw

银虫 (小有名气)

160rpm摇菌60h, 12000rpm,5min 离心收集菌体。
加Saline-EDTA buffer(pH8.0)500ul 悬浮菌体。
1. Lysozyme(10ug/uL, 10ul), 37度,30min;
2.ProteinaseK, 55度,20min;(这步操作之后,有些tube中的solution是透明的,另外一些tube还是浑浊的)
3.40uL25% SDS, 水浴65度,10min;
4.2%CTAB100ul(预热到65度), 5M醋酸钠buffer180ul;mix 10min(动作很轻柔)
5.10000rpm离心十分钟;
6.氯仿:异戊醇(24:1)抽提两次(中间白色夹层特别容易被吸起,很难去除,最后选择放弃一部分水相);
7.2倍体积冷乙醇沉淀(加入冷乙醇后可以看到絮状沉淀,但有些样品中有小气泡,可能和加入乙醇时用力过猛有关?);
8.10000rpm离心十分钟,离心管底部白色沉淀肉眼可见;
9.70%乙醇洗涤一次;
8.室温自然干燥,得到透明或淡黄色物质,适量的nucleic acid -free water 溶解(上次操作该用pH8.0TE了)。
以上是我修改后的步骤,还是不清楚问题出在哪里。
世界依然美好,值得为之奋斗!
17楼2009-06-10 16:57:59
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