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jiajiawuwsw银虫 (小有名气)
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[交流]
提到的DNA总降解是怎么回事
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我做的是醋酸菌，G-，最近提到的DNA降解特别严重，电泳结果有时候全部是弥散，看不到主带。 我用的方法如下： 收集菌体，加Saline-EDTA buffer(pH8.0), 1. Lysozyme+RNase, 37度,30min； 2.ProteinaseK, 37度，1h; 3.10uL25% SDS， 水浴65度，10min; 4.CTAB, 醋酸钠buffer； 5.氯仿：异戊醇（24：1）抽提两次； 6.冷乙醇沉淀； 7.70%乙醇洗涤一次； 8.干燥，nucleic acid -free water 溶解。 通常在冷乙醇沉淀离心后可以看到明显的白色沉淀，Nano-drop结果也很高，但是电泳结果却是弥散的带。过去，我一直在用这个方法，但最近总是拿不到DNA，酶和试剂也都换了一遍，结果还是不行。 可能我有些重要的细节没有注意好，请各位不吝赐教！ |
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jiajiawuwsw
银虫 (小有名气)
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160rpm摇菌60h, 12000rpm,5min 离心收集菌体。 加Saline-EDTA buffer(pH8.0)500ul 悬浮菌体。 1. Lysozyme（10ug/uL, 10ul）, 37度,30min； 2.ProteinaseK, 55度，20min;(这步操作之后，有些tube中的solution是透明的，另外一些tube还是浑浊的) 3.40uL25% SDS， 水浴65度，10min; 4.2%CTAB100ul（预热到65度）, 5M醋酸钠buffer180ul；mix 10min(动作很轻柔) 5.10000rpm离心十分钟； 6.氯仿：异戊醇（24：1）抽提两次（中间白色夹层特别容易被吸起，很难去除，最后选择放弃一部分水相）； 7.2倍体积冷乙醇沉淀（加入冷乙醇后可以看到絮状沉淀，但有些样品中有小气泡，可能和加入乙醇时用力过猛有关？）； 8.10000rpm离心十分钟，离心管底部白色沉淀肉眼可见； 9.70%乙醇洗涤一次； 8.室温自然干燥，得到透明或淡黄色物质，适量的nucleic acid -free water 溶解（上次操作该用pH8.0TE了）。 以上是我修改后的步骤，还是不清楚问题出在哪里。 |
17楼2009-06-10 16:57:59
wjswj
木虫 (正式写手)
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