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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 重组质粒导入农杆菌，菌落PCR假阳性该怎么处理
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杨锡369

新虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒导入农杆菌，菌落PCR假阳性该怎么处理 已有1人参与

我把重组好的质粒从大肠杆菌DH5α中抽提出来（重组质粒测序鉴定目的基因已经放进去了的），然后把抽提的质粒导入农杆菌感受态，在kan50抗性平板上28℃培养两天，挑单菌落做菌落PCR，怎么都P不出来。
请问各位小木虫遇到这种情况该怎么处理？怎么才能提升阳性率，降低假阳性？@gyesang
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1楼 2019-05-16 12:48:49
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杨锡369

新虫 (小有名气)
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杨锡369: 回帖置顶 2019-05-16 13:33:27
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2楼: Originally posted by freehomefc at 2019-05-16 13:05:11
你的抗生素用错了。你用的抗生素应该是农杆菌加重组载体的抗性，而不只是重组载体的抗性

有较高转化率的重组质粒导入农杆菌的转化方法推荐吗？
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3楼2019-05-16 13:08:20
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zhz0809

新虫 (初入文坛)
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10楼: Originally posted by 杨锡369 at 2019-05-17 18:33:46
平板长接近1000个斑需要几天啊，我之前加只加kan抗生素，48h最多有20个单菌落。...

需要48h-60h左右，一般36h能看见克隆，48h能挑斑鉴定！

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13楼2019-05-18 13:26:41
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freehomefc

新虫 (小有名气)
你的抗生素用错了。你用的抗生素应该是农杆菌加重组载体的抗性，而不只是重组载体的抗性

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杨锡369
2楼2019-05-16 13:05:11
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杨锡369

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by freehomefc at 2019-05-16 13:05:11
你的抗生素用错了。你用的抗生素应该是农杆菌加重组载体的抗性，而不只是重组载体的抗性

为什么单抗不行，而要用双抗生素呢
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4楼2019-05-16 13:13:01
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freehomefc

新虫 (小有名气)
双抗可以用来检测重组载体是否导入进农杆菌，单抗的即使没有转入也可以存活，双抗跟加保险

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5楼2019-05-16 13:56:56
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freehomefc

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 杨锡369 at 2019-05-16 13:08:20
有较高转化率的重组质粒导入农杆菌的转化方法推荐吗？...

农杆菌转入应该是很高效的，只要转进了就能检测出来的

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6楼2019-05-16 13:59:23
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杨锡369

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by freehomefc at 2019-05-16 13:56:56
双抗可以用来检测重组载体是否导入进农杆菌，单抗的即使没有转入也可以存活，双抗跟加保险

筛选阳性农杆菌的抗性是什么呢？利福平吗？
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7楼2019-05-16 14:12:10
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freehomefc

新虫 (小有名气)
农杆菌GV 3101的抗性是利福平，还有其他的农杆菌，我没用过不确定，你在用的时候可以搜索一下它对应的抗性

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8楼2019-05-16 22:56:38
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zhz0809

新虫 (初入文坛)
1.建议涂板50ug/ml Kan+50ug/ml Rif(GV3101 EHA105 AHL1 LBA4404，其它农杆菌按说明书添加)  单独的Kan 会长少量杂菌（我们的经验全涂<10个斑），如果你的板子长了接近1000个，肯定是转进去了
2.农杆菌菌落PCR不容易做，可以尝试质粒小提10ml菌液再做PCR   或者做35个循环，选用好的PCRMIX
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杨锡369 杨锡369
9楼2019-05-17 10:25:16
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杨锡369

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhz0809 at 2019-05-17 10:25:16
1.建议涂板50ug/ml Kan+50ug/ml Rif(GV3101 EHA105 AHL1 LBA4404，其它农杆菌按说明书添加)  单独的Kan 会长少量杂菌（我们的经验全涂&lt;10个斑），如果你的板子长了接近1000个，肯定是转进去了
2.农杆菌菌落 ...

平板长接近1000个斑需要几天啊，我之前加只加kan抗生素，48h最多有20个单菌落。
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10楼2019-05-17 18:33:46
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