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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 重组质粒导入农杆菌，菌落PCR假阳性该怎么处理
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杨锡369

新虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒导入农杆菌，菌落PCR假阳性该怎么处理 已有1人参与

我把重组好的质粒从大肠杆菌DH5α中抽提出来（重组质粒测序鉴定目的基因已经放进去了的），然后把抽提的质粒导入农杆菌感受态，在kan50抗性平板上28℃培养两天，挑单菌落做菌落PCR，怎么都P不出来。
请问各位小木虫遇到这种情况该怎么处理？怎么才能提升阳性率，降低假阳性？@gyesang
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1楼 2019-05-16 12:48:49
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zhz0809

新虫 (初入文坛)
1.建议涂板50ug/ml Kan+50ug/ml Rif(GV3101 EHA105 AHL1 LBA4404，其它农杆菌按说明书添加)  单独的Kan 会长少量杂菌（我们的经验全涂<10个斑），如果你的板子长了接近1000个，肯定是转进去了
2.农杆菌菌落PCR不容易做，可以尝试质粒小提10ml菌液再做PCR   或者做35个循环，选用好的PCRMIX
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杨锡369 杨锡369
9楼2019-05-17 10:25:16
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freehomefc

新虫 (小有名气)
你的抗生素用错了。你用的抗生素应该是农杆菌加重组载体的抗性，而不只是重组载体的抗性

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杨锡369
2楼2019-05-16 13:05:11
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杨锡369

新虫 (小有名气)
送红花一朵
杨锡369: 回帖置顶 2019-05-16 13:33:27
引用回帖:
2楼: Originally posted by freehomefc at 2019-05-16 13:05:11
你的抗生素用错了。你用的抗生素应该是农杆菌加重组载体的抗性，而不只是重组载体的抗性

有较高转化率的重组质粒导入农杆菌的转化方法推荐吗？
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3楼2019-05-16 13:08:20
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杨锡369

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by freehomefc at 2019-05-16 13:05:11
你的抗生素用错了。你用的抗生素应该是农杆菌加重组载体的抗性，而不只是重组载体的抗性

为什么单抗不行，而要用双抗生素呢
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4楼2019-05-16 13:13:01
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