应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助：大肠杆菌red同源重组一直出现假阳性
91/1返回列表
查看: 4307  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

cjw_0926

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助：大肠杆菌red同源重组一直出现假阳性 已有3人参与

最近一直在做red同源重组，将外源基因整合至K-12大肠杆菌染色体组上，电转后能长出菌落，但验证全都是假阳性线性
1.我用的是链霉素筛选，不知道是不是因为抗生素原因导致这么多假阳性？
2.我的整合片段较大有4000bp做有，同源臂选的是50bp，会不会太短，我是否需要延长同源臂长度？但查阅文献感觉K系列菌株50bp貌似足够了
3.是不是我挑的菌落太少？板上长了很多，但我来来回回也挑了有四五十个了，但一直都是假阳性，而且我在新的链霉素抗性板上划线，虽然假阳性但也能长起来。。
我的试验步骤：
以质粒为模板扩增打靶片段，DpnI消化后浓缩到260ng/uL打靶片段。
电转感受态细胞制备，预冷纯水洗一次，10%甘油洗两次，最后分装100ul每管，电转加入5ul片段
电击后加入1ml SOC培养基，170rpm 3h，离心浓缩到100ul涂板，37℃培养16h
菌落PCR是在整合片段上下游200bp开外

求各位大神指导！在这个基因上耗了太长时间了，要崩溃了。。。。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2019-04-27 14:04:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

4017

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主，你好，能不能惠赠我一点K-12大肠杆菌
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2019-04-27 18:22:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mengqiang327

银虫 (初入文坛)
根据你的描述，建议做一个K-12的耐药性试验，将链霉素稀释成不同的工作浓度，可能工作浓度调高一点假阳性就少了。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
胸膛走在思想前面的烟酒僧
3楼2019-05-04 12:45:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

成事想心

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主你好。我目前也在做同源重组。是将一个基因片段接入一个质粒上面，目前已经通过电泳证实载体和目标片段连在一起了。但就是筛选阳性克隆子时都是假阳性。现在也不知道怎么回事。希望有大佬可以帮忙解答。如果楼主解决了相应的困惑，我们也可以交流一下。感谢。
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2019-09-19 11:46:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (正式写手)
本帖仅楼主可见
5楼2019-09-19 21:23:07
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

寒冬夜寂

新虫 (小有名气)
楼主你好，我也在做这方面的研究，不知道能否加楼主的QQ询问一些问题，谢谢楼主了
赞一下 回复此楼
6楼2019-12-17 17:20:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

2339773049

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小木无虫 at 2019-09-19 21:23:07
我有k12菌
...

价格是？
回复此楼
7楼2020-08-20 21:37:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

donkey2017

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by 4017 at 2019-04-27 18:22:32
楼主，你好，能不能惠赠我一点K-12大肠杆菌

我有K-12 MG1655， 需要可以私信
赞一下 回复此楼
8楼2020-08-21 09:13:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

donkey2017

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 2339773049 at 2020-08-20 21:37:50
价格是？

我有K-12 MG1655,需要可以私信
赞一下 回复此楼
9楼2020-08-21 09:13:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 cjw_0926 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 关于filecode，很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +3 布布和一二 2026-08-08 3/150 2026-08-08 18:15 by Lightingo
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 4/200 2026-08-08 17:22 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 qTvzQBRAHjCi 2026-08-07 5/250 2026-08-08 17:02 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 5/250 2026-08-08 16:27 by oEVWOejN9taj
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 4/200 2026-08-08 16:22 by oEVWOejN9taj
[博后之家] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 4/200 2026-08-08 16:02 by oEVWOejN9taj
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 5/250 2026-08-08 15:59 by oEVWOejN9taj
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 Vi50GxzrFcSG 2026-08-07 6/300 2026-08-08 15:07 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +5 布布和一二 2026-08-08 8/400 2026-08-08 14:54 by archvillain
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 6/300 2026-08-08 14:42 by oEVWOejN9taj
[基金申请] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 KXLV3nuBVBY7 2026-08-07 5/250 2026-08-08 14:07 by oEVWOejN9taj
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 3/150 2026-08-08 03:47 by 6vVgjDL4CnGu
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] 听说今天filecode变了 +24 布布和一二 2026-08-06 47/2350 2026-08-07 16:02 by zhiyanjiang
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] 纯娱乐，不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 18/900 2026-08-04 14:42 by archvillain
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭