| 查看: 4468 | 回复: 8 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
求助：大肠杆菌red同源重组一直出现假阳性 已有3人参与
|
||
|
最近一直在做red同源重组，将外源基因整合至K-12大肠杆菌染色体组上，电转后能长出菌落，但验证全都是假阳性线性 1.我用的是链霉素筛选，不知道是不是因为抗生素原因导致这么多假阳性？ 2.我的整合片段较大有4000bp做有，同源臂选的是50bp，会不会太短，我是否需要延长同源臂长度？但查阅文献感觉K系列菌株50bp貌似足够了 3.是不是我挑的菌落太少？板上长了很多，但我来来回回也挑了有四五十个了，但一直都是假阳性，而且我在新的链霉素抗性板上划线，虽然假阳性但也能长起来。。 我的试验步骤： 以质粒为模板扩增打靶片段，DpnI消化后浓缩到260ng/uL打靶片段。 电转感受态细胞制备，预冷纯水洗一次，10%甘油洗两次，最后分装100ul每管，电转加入5ul片段 电击后加入1ml SOC培养基，170rpm 3h，离心浓缩到100ul涂板，37℃培养16h 菌落PCR是在整合片段上下游200bp开外 求各位大神指导！在这个基因上耗了太长时间了，要崩溃了。。。。  |
回复此楼» 猜你喜欢
ADC标杆分子T-DM1全解析：从结构设计到实验室应用的技术要点
已经有0人回复
-
HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有149人回复
-
His标签蛋白纯化怎么才能快？
已经有0人回复
-
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
-
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用
已经有0人回复
-
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点
已经有0人回复
-
PRMT5·MTA 抑制剂 MRTX1719 的科研应用
已经有0人回复
-
SW033291 科研使用解析：分子特征、储存与实验获取要点
已经有0人回复
-
泛 RAS 抑制新思路：大环肽拟似物如何同时牵住突变型与野生型 RAS？
已经有0人回复
-
TYK2/JAK1 双靶点工具化合物 Brepocitinib：激酶选择性、研究进展与实验应用全解析
已经有0人回复
 本帖仅楼主可见 |
5楼2019-09-19 21:23:07
2楼2019-04-27 18:22:32
mengqiang327
银虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 727.9
- 帖子: 40
- 在线: 58.5小时
- 虫号: 3996849
- 注册: 2015-07-29
- 性别: GG
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
3楼2019-05-04 12:45:12
4楼2019-09-19 11:46:29