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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助：大肠杆菌red同源重组一直出现假阳性
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cjw_0926

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助：大肠杆菌red同源重组一直出现假阳性 已有3人参与

最近一直在做red同源重组，将外源基因整合至K-12大肠杆菌染色体组上，电转后能长出菌落，但验证全都是假阳性线性
1.我用的是链霉素筛选，不知道是不是因为抗生素原因导致这么多假阳性？
2.我的整合片段较大有4000bp做有，同源臂选的是50bp，会不会太短，我是否需要延长同源臂长度？但查阅文献感觉K系列菌株50bp貌似足够了
3.是不是我挑的菌落太少？板上长了很多，但我来来回回也挑了有四五十个了，但一直都是假阳性，而且我在新的链霉素抗性板上划线，虽然假阳性但也能长起来。。
我的试验步骤：
以质粒为模板扩增打靶片段，DpnI消化后浓缩到260ng/uL打靶片段。
电转感受态细胞制备，预冷纯水洗一次，10%甘油洗两次，最后分装100ul每管，电转加入5ul片段
电击后加入1ml SOC培养基，170rpm 3h，离心浓缩到100ul涂板，37℃培养16h
菌落PCR是在整合片段上下游200bp开外

求各位大神指导！在这个基因上耗了太长时间了，要崩溃了。。。。
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1楼 2019-04-27 14:04:57
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4017

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主，你好，能不能惠赠我一点K-12大肠杆菌
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2楼2019-04-27 18:22:32
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mengqiang327

银虫 (初入文坛)
根据你的描述，建议做一个K-12的耐药性试验，将链霉素稀释成不同的工作浓度，可能工作浓度调高一点假阳性就少了。

发自小木虫Android客户端
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胸膛走在思想前面的烟酒僧
3楼2019-05-04 12:45:12
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成事想心

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主你好。我目前也在做同源重组。是将一个基因片段接入一个质粒上面，目前已经通过电泳证实载体和目标片段连在一起了。但就是筛选阳性克隆子时都是假阳性。现在也不知道怎么回事。希望有大佬可以帮忙解答。如果楼主解决了相应的困惑，我们也可以交流一下。感谢。
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4楼2019-09-19 11:46:29
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匿名

用户注销 (正式写手)
本帖仅楼主可见
5楼2019-09-19 21:23:07
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寒冬夜寂

新虫 (小有名气)
楼主你好，我也在做这方面的研究，不知道能否加楼主的QQ询问一些问题，谢谢楼主了
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6楼2019-12-17 17:20:48
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2339773049

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小木无虫 at 2019-09-19 21:23:07
我有k12菌
...

价格是？
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7楼2020-08-20 21:37:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

donkey2017

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by 4017 at 2019-04-27 18:22:32
楼主，你好，能不能惠赠我一点K-12大肠杆菌

我有K-12 MG1655， 需要可以私信
赞一下 回复此楼
8楼2020-08-21 09:13:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

donkey2017

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 2339773049 at 2020-08-20 21:37:50
价格是？

我有K-12 MG1655,需要可以私信
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9楼2020-08-21 09:13:53
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