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求助：大肠杆菌red同源重组一直出现假阳性 已有3人参与
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最近一直在做red同源重组，将外源基因整合至K-12大肠杆菌染色体组上，电转后能长出菌落，但验证全都是假阳性线性 1.我用的是链霉素筛选，不知道是不是因为抗生素原因导致这么多假阳性？ 2.我的整合片段较大有4000bp做有，同源臂选的是50bp，会不会太短，我是否需要延长同源臂长度？但查阅文献感觉K系列菌株50bp貌似足够了 3.是不是我挑的菌落太少？板上长了很多，但我来来回回也挑了有四五十个了，但一直都是假阳性，而且我在新的链霉素抗性板上划线，虽然假阳性但也能长起来。。 我的试验步骤： 以质粒为模板扩增打靶片段，DpnI消化后浓缩到260ng/uL打靶片段。 电转感受态细胞制备，预冷纯水洗一次，10%甘油洗两次，最后分装100ul每管，电转加入5ul片段 电击后加入1ml SOC培养基，170rpm 3h，离心浓缩到100ul涂板，37℃培养16h 菌落PCR是在整合片段上下游200bp开外 求各位大神指导！在这个基因上耗了太长时间了，要崩溃了。。。。  |
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mengqiang327
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