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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » Western blot 转膜使用甲醇问题求教
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一个不小心就

金虫 (正式写手)

[求助] Western blot 转膜使用甲醇问题求教 已有2人参与

Western blot转膜液里为什么要加20%甲醇？？我搜索并得到以下解释，但不确定是否正确：

1、甲醇可以可以减少电流，从而降低产热。
     疑问：直接设置更低的转膜电压不就可以了，何必加甲醇。

2、甲醇可以去除蛋白上的SDS
      疑问：SDS去除了如何保证蛋白向正极移动。

3、不加甲醇蛋白转不上膜
      疑问：这个说法的原理是什么？我曾用过购买的10× 转膜液， 直接用水稀释即可使用，蛋白完全能顺利转上膜，之后也blot出了条带。
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1楼 2019-04-11 16:36:02
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lirol

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
（从别处粘来的，觉得这个解释更合理些，由于甲醇有一定的毒性，我们是用的乙醇，使用效果也不错。）PVDF膜一定要在纯甲醇里浸润的！不然蛋白结合不上去。在100%甲醇里短暂浸润,其目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合。小分子及大分子量的蛋白转移时，多加或不加甲醇也是这个目的。因为小分子不容易和膜结合而大分子更容易。转膜的过程，是一个恒定电场下，电荷转移的过程。这个过程中，蛋白的转移和电场强度以及自身电荷有关。你加入的甲醇主要是降低电导的作用。防止你的溶液过热。
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2楼2019-04-12 08:44:57
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匿名

用户注销 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
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3楼2019-04-12 08:54:57
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一个不小心就

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lirol at 2019-04-12 08:44:57
（从别处粘来的，觉得这个解释更合理些，由于甲醇有一定的毒性，我们是用的乙醇，使用效果也不错。）PVDF膜一定要在纯甲醇里浸润的！不然蛋白结合不上去。在100%甲醇里短暂浸润,其目的是为了活化PVDF膜上面的正电基 ...

你们用乙醇的比例是多少？活化的时候也用乙醇吗？
转膜过程中也要加甲醇，难道说活化以后的膜还会去活化？
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4楼2019-04-12 15:46:32
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lirol

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 一个不小心就 at 2019-04-12 15:46:32
你们用乙醇的比例是多少？活化的时候也用乙醇吗？
转膜过程中也要加甲醇，难道说活化以后的膜还会去活化？...

我们是用甲醇的地方都改成乙醇了，比例一样的。转膜过程中的甲醇主要是降低电导，防止过热？无论是湿转还是半干转都要注意电流的变化，你可以试试看加不加甲醇电流的差别。
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5楼2019-04-12 16:02:45
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一个不小心就

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lirol at 2019-04-12 16:02:45
我们是用甲醇的地方都改成乙醇了，比例一样的。转膜过程中的甲醇主要是降低电导，防止过热？无论是湿转还是半干转都要注意电流的变化，你可以试试看加不加甲醇电流的差别。...

我找到了其他课题组也用乙醇代替的回答。 我觉得降低电导防止过热没有必要用甲醇，毕竟太毒了，不划算，开始使就用冰的buffer，设置更小的电压就行了。
也有人表示转膜不用甲醇是可以的（活化的时候还是要的）。加了甲醇有利于蛋白分子更好的结合到膜上，等等。以下连接给你参考：
https://www.researchgate.net/pos ... the_transfer_buffer
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6楼2019-04-12 19:37:02
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一个不小心就

金虫 (正式写手)
以下是我找到的答案，供大家参考。
https://www.researchgate.net/pos ... the_transfer_buffer

结论是：加了甲醇有利于蛋白的固定到膜上，特别是小分子的蛋白，对于大分子的蛋白可能是不利的，乙醇可以代替甲醇使用。
Thermo fisher官网的说明：
Methanol in the transfer buffer aids in stripping the SDS from proteins in SDS-PAGE gels, increasing their ability to bind to support membranes. However, methanol can inactivate enzymes required for downstream analyses, and it can shrink the gel and membrane, which may increase the transfer time of large molecular weight proteins (150,000 Da) with poor solubility in methanol. In the absence of methanol, though, protein gels may swell in low ionic strength buffers, and therefore it is recommended to pre-swell gels for 30 minutes to 1 hour to prevent band distortion.
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7楼2019-04-12 19:41:58
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123BIOCAT

铁虫 (著名写手)
我们一般用无水乙醇

发自小木虫Android客户端
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8楼2019-06-10 12:31:09
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好学生。。。

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lirol at 2019-04-12 08:44:57
（从别处粘来的，觉得这个解释更合理些，由于甲醇有一定的毒性，我们是用的乙醇，使用效果也不错。）PVDF膜一定要在纯甲醇里浸润的！不然蛋白结合不上去。在100%甲醇里短暂浸润,其目的是为了活化PVDF膜上面的正电基 ...

想问一下多大算大分子量蛋白
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9楼2024-09-13 19:23:26
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