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一个不小心就

金虫 (正式写手)

[求助] Western blot 转膜使用甲醇问题求教 已有2人参与

Western blot转膜液里为什么要加20%甲醇??我搜索并得到以下解释,但不确定是否正确:

1、甲醇可以可以减少电流,从而降低产热。
     疑问:直接设置更低的转膜电压不就可以了,何必加甲醇。

2、甲醇可以去除蛋白上的SDS
      疑问:SDS去除了如何保证蛋白向正极移动。

3、不加甲醇蛋白转不上膜
      疑问:这个说法的原理是什么?我曾用过购买的10× 转膜液, 直接用水稀释即可使用,蛋白完全能顺利转上膜,之后也blot出了条带。
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一个不小心就

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by lirol at 2019-04-12 16:02:45
我们是用甲醇的地方都改成乙醇了,比例一样的。转膜过程中的甲醇主要是降低电导,防止过热?无论是湿转还是半干转都要注意电流的变化,你可以试试看加不加甲醇电流的差别。...

我找到了其他课题组也用乙醇代替的回答。 我觉得降低电导防止过热没有必要用甲醇,毕竟太毒了,不划算,开始使就用冰的buffer,设置更小的电压就行了。
也有人表示转膜不用甲醇是可以的(活化的时候还是要的)。加了甲醇有利于蛋白分子更好的结合到膜上,等等。以下连接给你参考:
https://www.researchgate.net/pos ... the_transfer_buffer
6楼2019-04-12 19:37:02
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lirol

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
(从别处粘来的,觉得这个解释更合理些,由于甲醇有一定的毒性,我们是用的乙醇,使用效果也不错。)PVDF膜一定要在纯甲醇里浸润的!不然蛋白结合不上去。在100%甲醇里短暂浸润,其目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合。小分子及大分子量的蛋白转移时,多加或不加甲醇也是这个目的。因为小分子不容易和膜结合而大分子更容易。转膜的过程,是一个恒定电场下,电荷转移的过程。这个过程中,蛋白的转移和电场强度以及自身电荷有关。你加入的甲醇主要是降低电导的作用。防止你的溶液过热。
2楼2019-04-12 08:44:57
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匿名

用户注销 (正式写手)

感谢参与,应助指数 +1
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3楼2019-04-12 08:54:57
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一个不小心就

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lirol at 2019-04-12 08:44:57
(从别处粘来的,觉得这个解释更合理些,由于甲醇有一定的毒性,我们是用的乙醇,使用效果也不错。)PVDF膜一定要在纯甲醇里浸润的!不然蛋白结合不上去。在100%甲醇里短暂浸润,其目的是为了活化PVDF膜上面的正电基 ...

你们用乙醇的比例是多少?活化的时候也用乙醇吗?
转膜过程中也要加甲醇,难道说活化以后的膜还会去活化?
4楼2019-04-12 15:46:32
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