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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » Western blot 转膜使用甲醇问题求教
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一个不小心就

金虫 (正式写手)

[求助] Western blot 转膜使用甲醇问题求教 已有2人参与

Western blot转膜液里为什么要加20%甲醇？？我搜索并得到以下解释，但不确定是否正确：

1、甲醇可以可以减少电流，从而降低产热。
     疑问：直接设置更低的转膜电压不就可以了，何必加甲醇。

2、甲醇可以去除蛋白上的SDS
      疑问：SDS去除了如何保证蛋白向正极移动。

3、不加甲醇蛋白转不上膜
      疑问：这个说法的原理是什么？我曾用过购买的10× 转膜液， 直接用水稀释即可使用，蛋白完全能顺利转上膜，之后也blot出了条带。
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1楼 2019-04-11 16:36:02
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一个不小心就

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lirol at 2019-04-12 16:02:45
我们是用甲醇的地方都改成乙醇了，比例一样的。转膜过程中的甲醇主要是降低电导，防止过热？无论是湿转还是半干转都要注意电流的变化，你可以试试看加不加甲醇电流的差别。...

我找到了其他课题组也用乙醇代替的回答。 我觉得降低电导防止过热没有必要用甲醇，毕竟太毒了，不划算，开始使就用冰的buffer，设置更小的电压就行了。
也有人表示转膜不用甲醇是可以的（活化的时候还是要的）。加了甲醇有利于蛋白分子更好的结合到膜上，等等。以下连接给你参考：
https://www.researchgate.net/pos ... the_transfer_buffer
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6楼2019-04-12 19:37:02
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lirol

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
（从别处粘来的，觉得这个解释更合理些，由于甲醇有一定的毒性，我们是用的乙醇，使用效果也不错。）PVDF膜一定要在纯甲醇里浸润的！不然蛋白结合不上去。在100%甲醇里短暂浸润,其目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合。小分子及大分子量的蛋白转移时，多加或不加甲醇也是这个目的。因为小分子不容易和膜结合而大分子更容易。转膜的过程，是一个恒定电场下，电荷转移的过程。这个过程中，蛋白的转移和电场强度以及自身电荷有关。你加入的甲醇主要是降低电导的作用。防止你的溶液过热。
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2楼2019-04-12 08:44:57
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匿名

用户注销 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
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3楼2019-04-12 08:54:57
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一个不小心就

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lirol at 2019-04-12 08:44:57
（从别处粘来的，觉得这个解释更合理些，由于甲醇有一定的毒性，我们是用的乙醇，使用效果也不错。）PVDF膜一定要在纯甲醇里浸润的！不然蛋白结合不上去。在100%甲醇里短暂浸润,其目的是为了活化PVDF膜上面的正电基 ...

你们用乙醇的比例是多少？活化的时候也用乙醇吗？
转膜过程中也要加甲醇，难道说活化以后的膜还会去活化？
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4楼2019-04-12 15:46:32
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