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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » qPCR引物设计问题（急急急急急！）
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狂暴小子

新虫 (正式写手)

[求助] qPCR引物设计问题（急急急急急！） 已有1人参与

请求各位虫友的帮助：
本人即将要做qPCR—菌种定量的实验，我想的是针对目的菌株设计出特异性引物，其他杂菌不会扩增出相应的基因，请问要怎样设计这种类型的特异性引物呢，我看了很多硕博论文，还不是特别明白，希望虫友能够指点迷津，已经卡在这个点卡了一个多星期了，一直没有进展。
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1楼 2019-04-09 08:42:08
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美亿美生物

捐助贵宾 (职业作家)

技术服务-实验代做
哎，这个嘛，加油加油

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2楼2019-04-09 09:25:34
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王艳xinwei

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2019-04-09 22:03:34
你可以查找该目的菌种相关文献，最好找到全基因组序列，可以找到该菌种某些基因序列的登陆号，从ncbi中得到全序列，再利用引物设计软件设计特异性引物，一般定量引物比较短，扩增前段200pb左右；如果没有公布的目的基因全长或前段，你可以找其他菌种具有公开的基因全长设计非特性引物，再对你的目的菌进行扩增，测序，比对等鉴定过程；另一种方法就是设计某一基因的引物，做race获得基因全长，再设计定量引物；最后另一种方法就是拿钱让试剂公司做该菌种的转录组测序，在获得的结果中找到你感兴趣的基因设计定量引物！以上方法仅供参考！

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坚持就是胜利
3楼2019-04-09 09:47:39
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yipobing

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2019-05-29 22:54:35
首先，尽可能先确定你的模板（如果是混合菌的话）有哪些，尽可能从ncbi 或者ucsc 找到 RNA 序列，一般已发表或者已上传的数据知道菌株信息都能找到。确定这些你就能确定特异性部分了，然后设计引物，推荐一个好用的在线软件https://sg.idtdna.com/site/accou ... uest%2FHome%2FIndex
希望有帮助
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4楼2019-04-10 15:59:44
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狂暴小子

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yipobing at 2019-04-10 15:59:44
首先，尽可能先确定你的模板（如果是混合菌的话）有哪些，尽可能从ncbi 或者ucsc 找到 RNA 序列，一般已发表或者已上传的数据知道菌株信息都能找到。确定这些你就能确定特异性部分了，然后设计引物，推荐一个好用的 ...

好的好的，十分感谢

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5楼2019-04-15 19:36:39
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狂暴小子

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 王艳xinwei at 2019-04-09 09:47:39
你可以查找该目的菌种相关文献，最好找到全基因组序列，可以找到该菌种某些基因序列的登陆号，从ncbi中得到全序列，再利用引物设计软件设计特异性引物，一般定量引物比较短，扩增前段200pb左右；如果没有公布的目的 ...

大概明白了点，谢谢了

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6楼2019-04-15 19:37:00
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ingoing

新虫 (小有名气)
你好！你解决了吗？我也是这种情况。。。但是混菌的话，内参基因怎么找啊

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7楼2019-05-12 18:23:55
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狂暴小子

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ingoing at 2019-05-12 18:23:55
你好！你解决了吗？我也是这种情况。。。但是混菌的话，内参基因怎么找啊

不好意思，我这块是做菌种定量的研究，用的是绝对定量法，内参基因应该是相对定量吧？
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8楼2019-05-29 20:03:30
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ingoing

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 狂暴小子 at 2019-05-29 20:03:30
不好意思，我这块是做菌种定量的研究，用的是绝对定量法，内参基因应该是相对定量吧？...

好的吧，谢谢啦

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9楼2019-05-29 21:04:46
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