应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请问：用什么方法测定蛋白含量？
91/1返回列表
查看: 1463  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

yjc8183

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 请问：用什么方法测定蛋白含量？

RT，近来计划测定一下动物组织的蛋白含量，查了下资料，有用普通分光光度计的，有用酶标仪的。这两者到底有没有差别，区别在哪里，希望思考过此问题并用过的大侠解答一下，顺便说说注意点。
另外，测定所用试剂也有很多种：BCA、lowry 法（folin 酚试剂法）、Bradford 法（考马斯亮蓝染色法），尽管看了许多文献，还是拿不定注意，请用过的虫友叙说一二，再次小虫多谢了！
没有用过的或者搜索出来结果的，在此谢谢你，就不要回答了。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

污水处理 我的新领域

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
征婚家穷人丑，一米四九。小学文化，农村户口。破屋三间，薄田一亩。开门睡觉，治安靠狗。冷锅热灶，老婆没有。一年四季，药不离口。今日上网，广征女友。革命路
1楼 2009-05-13 15:50:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fxl530

木虫 (小有名气)
★
yjc8183(金币+1,VIP+0):非常感谢！请问酶标仪和分光光度计测定结果如何？如重复性、灵敏度等。 5-13 16:16
分光光度计和酶标仪没有区别的，酶标仪主要是一次可以测定多个样品，直接在酶标板中测定的。
lowry跟Brandford都可以，或者直接买试剂盒测定。Brandford法记得考马斯亮蓝一定是要过滤的否则根本不能用，切记。要注意的也就这个，其他的就直接照着方法做就行了。
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2009-05-13 16:07:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

2die2005

金虫 (正式写手)
★
yjc8183(金币+1,VIP+0):谢谢，你们也是用分光光度计吗？我的量很少的，呵呵 5-13 16:18
我们实验室都是用的lowry法，貌似还不错的。PS：我们实验室都是做藻类的，所以基本上用的都是这个方法。
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2009-05-13 16:15:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

guoxingjun2008

金虫 (正式写手)
Brandford法可以！
赞一下 回复此楼
4楼2009-05-13 16:22:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hihoney

铁杆木虫 (职业作家)
★
yjc8183(金币+1,VIP+0):谢谢！ 5-13 20:16
引用回帖:
Originally posted by guoxingjun2008 at 2009-5-13 16:22:
Brandford法可以！

有商品化的试剂盒，很方便。
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2009-05-13 20:06:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

baisuilan

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
yjc8183(金币+5,VIP+0):非常感谢！谢谢你的指教！ 5-14 12:48
一般来说，分光光度计测出来的数据比酶标仪精确。但是，酶标仪多使用96孔酶标板，一次可以测96个数据，而分光光度计一般一次只能测一个读数，这样分次测其实更容易引入误差。有时候连标准曲线都做不出来。
我们实验室是用酶标仪的 ， 考马斯亮蓝法，但SDS等去垢剂对吸光值有影响。适宜波长应该是595，但是酶标仪没有这个波长的，这也是个问题。我们就用最接近的620代替了，也可以用。
其实这些蛋白测定方法都不太精确，只能大致确定。如果想更精确，可以把你的样品梯度稀释一下多测几个重复。

[ Last edited by baisuilan on 2009-5-14 at 11:39 ]
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2009-05-14 11:36:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w.king124

金虫 (正式写手)
★
yjc8183(金币+1,VIP+0):谢谢！ 5-14 13:23
lowry 法和Bradford 法测定的范围不一样，只有在测定范围内蛋白质含量才和吸光度成正比，Bradford测量范围相对大一些，如果蛋白含量比较高的话，建议用Bradford。但是，配制溶液比较麻烦，而且很容易污染。
看好多国外的文献（植物），都是用的BCA法
赞一下 回复此楼
7楼2009-05-14 12:59:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuke009

铁杆木虫 (著名写手)
★
yjc8183(金币+1,VIP+0):谢谢！ 5-14 13:24
我一般都用Bradford 法，96孔板或者比色皿的都用过，当然多稀释几个梯度是必须的。
还有一种方法是酸水解成氨基酸，再测氨基酸的含量。
这些方法都很粗糙，不过楼主测测组织蛋白总含量，应该也不是要最精确的数据吧，应该够用了
赞一下 回复此楼
8楼2009-05-14 13:06:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

圆头

金虫 (小有名气)
1、Folin－酚试剂法（Lowry法）:灵敏度高(～5mg),原理是双缩脲反应,磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原,干扰物质有硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、各种硫醇.需时50分钟左右。具体方法见《药典》第三部。检测重现性好。主要蛋白质产品的定量检测。现在有商品的Folin试剂（Bio-Rad等公司)，不用实验室自己配制，克服了此方法的一大缺点。生化生物药品的质量标准中的蛋白定量大都用此法。


2、考马斯亮蓝法(Bradford法):1976年由Bradford建立。灵敏度最高(1mg),比Lowry法灵敏约4倍。原理是考马斯亮蓝G-250与蛋白质(主要是与蛋白质中的碱性氨基酸特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基)结合时，其最大吸收由465nm变为595nm。干扰物质有强碱性缓冲液、TritonX-100、SDS。需时20分钟左右。目前科研单位、高校普遍用此法，我感觉稳定性比Lowry法差一些。

3、凯氏定氮法（Kjedahl法）：最精典的蛋白含量测定方法，操作步骤多，复杂，要求的技术也较高一些。将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定，计算氮量，蛋白氮乘以6.25即推算出蛋白质含量。不少生化药用此法定氮或测蛋白含量。

4、紫外吸收法：原理是蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值OD280。蛋白质浓度可控制在0.1～1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，OD280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。

5、双缩脲法（Biuret法）：灵敏度低(1～10mg)，原理是多肽键＋碱性Cu2＋®紫色络合物，用于快速测定，但不太灵敏；准确度低一些。



6、总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml，45分钟内完成测定。原理是碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
赞一下(6人) 回复此楼
9楼2009-05-14 13:48:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yjc8183 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭