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yjc8183铁杆木虫 (著名写手)
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[交流]
请问：用什么方法测定蛋白含量？
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RT，近来计划测定一下动物组织的蛋白含量，查了下资料，有用普通分光光度计的，有用酶标仪的。这两者到底有没有差别，区别在哪里，希望思考过此问题并用过的大侠解答一下，顺便说说注意点。 另外，测定所用试剂也有很多种：BCA、lowry 法（folin 酚试剂法）、Bradford 法（考马斯亮蓝染色法），尽管看了许多文献，还是拿不定注意，请用过的虫友叙说一二，再次小虫多谢了！ 没有用过的或者搜索出来结果的，在此谢谢你，就不要回答了。 |
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2楼2009-05-13 16:07:41
3楼2009-05-13 16:15:38
guoxingjun2008
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4楼2009-05-13 16:22:08
hihoney 
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5楼2009-05-13 20:06:09
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yjc8183(金币+5,VIP+0):非常感谢！谢谢你的指教！ 5-14 12:48
yjc8183(金币+5,VIP+0):非常感谢！谢谢你的指教！ 5-14 12:48
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一般来说，分光光度计测出来的数据比酶标仪精确。但是，酶标仪多使用96孔酶标板，一次可以测96个数据，而分光光度计一般一次只能测一个读数，这样分次测其实更容易引入误差。有时候连标准曲线都做不出来。 我们实验室是用酶标仪的 ， 考马斯亮蓝法，但SDS等去垢剂对吸光值有影响。适宜波长应该是595，但是酶标仪没有这个波长的，这也是个问题。我们就用最接近的620代替了，也可以用。 其实这些蛋白测定方法都不太精确，只能大致确定。如果想更精确，可以把你的样品梯度稀释一下多测几个重复。 [ Last edited by baisuilan on 2009-5-14 at 11:39 ] |
6楼2009-05-14 11:36:47
w.king124
金虫 (正式写手)
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7楼2009-05-14 12:59:20
liuke009
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8楼2009-05-14 13:06:41
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1、Folin－酚试剂法（Lowry法）:灵敏度高(～5mg),原理是双缩脲反应,磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原,干扰物质有硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、各种硫醇.需时50分钟左右。具体方法见《药典》第三部。检测重现性好。主要蛋白质产品的定量检测。现在有商品的Folin试剂（Bio-Rad等公司)，不用实验室自己配制，克服了此方法的一大缺点。生化生物药品的质量标准中的蛋白定量大都用此法。 2、考马斯亮蓝法(Bradford法):1976年由Bradford建立。灵敏度最高(1mg),比Lowry法灵敏约4倍。原理是考马斯亮蓝G-250与蛋白质(主要是与蛋白质中的碱性氨基酸特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基)结合时，其最大吸收由465nm变为595nm。干扰物质有强碱性缓冲液、TritonX-100、SDS。需时20分钟左右。目前科研单位、高校普遍用此法，我感觉稳定性比Lowry法差一些。 3、凯氏定氮法（Kjedahl法）：最精典的蛋白含量测定方法，操作步骤多，复杂，要求的技术也较高一些。将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定，计算氮量，蛋白氮乘以6.25即推算出蛋白质含量。不少生化药用此法定氮或测蛋白含量。 4、紫外吸收法：原理是蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值OD280。蛋白质浓度可控制在0.1～1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，OD280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。 5、双缩脲法（Biuret法）：灵敏度低(1～10mg)，原理是多肽键＋碱性Cu2＋®紫色络合物，用于快速测定，但不太灵敏；准确度低一些。 6、总蛋白定量分析－BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml，45分钟内完成测定。原理是碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 |
9楼2009-05-14 13:48:08
