应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » XhoI 单酶切，再连接，为什么都是假阳性？
91/1返回列表
查看: 1164  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

安静的位置i

金虫 (小有名气)

[交流] XhoI 单酶切，再连接，为什么都是假阳性？

急！载体和目的片段都用XhoI单酶切后，再去磷酸化，再与目的片段连接，最后转化后长出50个克隆，结果都是假阳性，为什么啊？
        酶切体系：XhoI：2uL（Takara）
                       质粒：10uL
                       buffer:4uL
                       ddH2O:24uL
        37℃ 酶切3h

       去磷酸化：SAP：0.5uL（Promega）
                       buffer:3uL
                       ddH2O:7uL
             质粒酶切回收：20uL     

        37℃ 水浴15min 再65℃水浴15min，产物纯化回收
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2009-05-07 13:50:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
安静的位置i(金币+2,VIP+0): 5-8 10:48
1、没有切动。takara的工具酶都很垃圾。
2、加入酶切的质粒过多，你要根据酶活定义来调整加入质粒的量，而不是什么多少ul，这么说没任何意义
3、去磷酸化不彻底，但是promega的酶还是ok的，所以我觉得1、2的可能性高
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2009-05-07 13:55:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangqshijf2003

金虫 (小有名气)
质粒纯度和浓度不详，纯度太低切不动，浓度太高酶切不充分，去磷酸化不彻底
赞一下 回复此楼
3楼2009-05-07 14:04:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tuotuozw

银虫 (小有名气)
★
安静的位置i(金币+1,VIP+0): 5-11 19:19
XhoI 虽然是粘端，但其连接效率等于平端，所以你按照平端的连接条件吧！
赞一下 回复此楼
4楼2009-05-07 14:37:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

anik

银虫 (正式写手)
各楼上的见解很好。。。
赞一下 回复此楼
5楼2009-05-07 14:41:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
xho I一点都不难连……
赞一下 回复此楼
6楼2009-05-07 15:24:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xlongw1773

金虫 (小有名气)

博士
★ ★
安静的位置i(金币+2,VIP+0): 5-8 10:47
xho I酶比较奇怪，正常的PCR引物设计是末端加三个碱基做保护性碱基，就可以了，二xhoI 最好用四个，才能比较好切，再不行就连接T载体，从里面切出来，保证目的片段切完全。
连接吗，要用平端连接的条件。
单酶切连接载体用量要比双酶切用量大很多。所以载体也要切好，连接对照最好能一个不长。
赞一下(1人) 回复此楼
123
7楼2009-05-07 18:48:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

安静的位置i

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xlongw1773 at 2009-5-7 18:48:
xho I酶比较奇怪，正常的PCR引物设计是末端加三个碱基做保护性碱基，就可以了，二xhoI 最好用四个，才能比较好切，再不行就连接T载体，从里面切出来，保证目的片段切完全。
连接吗，要用平端连接的条件。
单酶切 ...

我就是连到了T载体上，而且载体自连的对照一个也没长。。。也许应该多加些载体。
赞一下 回复此楼
8楼2009-05-07 22:39:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xlongw1773

金虫 (小有名气)

博士
做个连接梯度。我曾有此单酶切连接，怎么都连不进去，后来把载体和基因的用量颠倒了下，结果长了一板子，全是阳性。
赞一下 回复此楼
123
9楼2009-05-08 10:01:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 安静的位置i 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿 西北大学 总分282 英语一62 求调剂 +3 18419759900 2026-03-25 3/150 2026-03-25 23:20 by peike
[考研] 290分调剂求助 +3 吉祥止止陈 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:58 by barlinike
[考研] 285求调剂 +3 AZMK 2026-03-24 3/150 2026-03-25 12:23 by userper
[考研] 材料调剂 +6 匹克i 2026-03-23 6/300 2026-03-24 21:09 by greychen00
[考研] 一志愿南航材料专317分求调剂 +5 炸呀炸呀炸薯条 2026-03-23 5/250 2026-03-24 16:52 by 星空星月
[考研] 292求调剂 +4 鹅鹅鹅额额额额� 2026-03-24 4/200 2026-03-24 16:41 by peike
[考研] 085404电子信息284分求调剂 +4 13659058978 2026-03-24 4/200 2026-03-24 12:15 by syl20081243
[考研] 279分求调剂 一志愿211 +18 chaojifeixia 2026-03-19 20/1000 2026-03-24 10:34 by dolphin_ycj
[考研] 276求调剂。有半年电池和半年高分子实习经历 +9 材料学257求调剂 2026-03-23 10/500 2026-03-24 07:36 by wangy0907
[考研] 291求调剂 +8 hhhhxn.. 2026-03-23 8/400 2026-03-23 23:15 by peike
[考研] 269求调剂 +4 我想读研11 2026-03-23 4/200 2026-03-23 21:25 by pswait
[考研] 276求调剂 +3 YNRYG 2026-03-21 4/200 2026-03-23 08:31 by 醉在风里
[考研] 317求调剂 +12 申子申申 2026-03-19 18/900 2026-03-22 22:23 by luoyongfeng
[考研] 311求调剂 +3 26研0 2026-03-20 3/150 2026-03-22 14:46 by ColorlessPI
[考研] 求调剂 +7 Auroracx 2026-03-22 7/350 2026-03-22 12:38 by 素颜倾城1988
[考研] 材料求调剂 +5 @taotao 2026-03-21 5/250 2026-03-21 20:55 by lbsjt
[考研] 0805材料320求调剂 +3 深海物语 2026-03-20 3/150 2026-03-21 15:46 by 无际的草原
[考研] 332求调剂 +3 凤凰院丁真 2026-03-20 3/150 2026-03-21 10:27 by luoyongfeng
[考研] 求调剂 +6 Mqqqqqq 2026-03-19 6/300 2026-03-21 08:04 by JourneyLucky
[考研] 一志愿 南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕 +5 @taotao 2026-03-20 5/250 2026-03-20 20:16 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭