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安静的位置i

金虫 (小有名气)

[交流] XhoI 单酶切,再连接,为什么都是假阳性?

急!载体和目的片段都用XhoI单酶切后,再去磷酸化,再与目的片段连接,最后转化后长出50个克隆,结果都是假阳性,为什么啊?
        酶切体系:XhoI:2uL(Takara)
                       质粒:10uL
                       buffer:4uL
                       ddH2O:24uL
        37℃ 酶切3h

       去磷酸化:SAP:0.5uL(Promega)
                       buffer:3uL
                       ddH2O:7uL
             质粒酶切回收:20uL     

        37℃ 水浴15min 再65℃水浴15min,产物纯化回收
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xlongw1773

金虫 (小有名气)

博士

做个连接梯度。我曾有此单酶切连接,怎么都连不进去,后来把载体和基因的用量颠倒了下,结果长了一板子,全是阳性。
123
9楼2009-05-08 10:01:26
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
安静的位置i(金币+2,VIP+0): 5-8 10:48
1、没有切动。takara的工具酶都很垃圾。
2、加入酶切的质粒过多,你要根据酶活定义来调整加入质粒的量,而不是什么多少ul,这么说没任何意义
3、去磷酸化不彻底,但是promega的酶还是ok的,所以我觉得1、2的可能性高
2楼2009-05-07 13:55:09
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zhangqshijf2003

金虫 (小有名气)

质粒纯度和浓度不详,纯度太低切不动,浓度太高酶切不充分,去磷酸化不彻底
3楼2009-05-07 14:04:15
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tuotuozw

银虫 (小有名气)


安静的位置i(金币+1,VIP+0): 5-11 19:19
XhoI 虽然是粘端,但其连接效率等于平端,所以你按照平端的连接条件吧!
4楼2009-05-07 14:37:20
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