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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » XhoI 单酶切，再连接，为什么都是假阳性？
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安静的位置i

金虫 (小有名气)

[交流] XhoI 单酶切，再连接，为什么都是假阳性？

急！载体和目的片段都用XhoI单酶切后，再去磷酸化，再与目的片段连接，最后转化后长出50个克隆，结果都是假阳性，为什么啊？
        酶切体系：XhoI：2uL（Takara）
                       质粒：10uL
                       buffer:4uL
                       ddH2O:24uL
        37℃ 酶切3h

       去磷酸化：SAP：0.5uL（Promega）
                       buffer:3uL
                       ddH2O:7uL
             质粒酶切回收：20uL     

        37℃ 水浴15min 再65℃水浴15min，产物纯化回收
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1楼 2009-05-07 13:50:59
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
安静的位置i(金币+2,VIP+0): 5-8 10:48
1、没有切动。takara的工具酶都很垃圾。
2、加入酶切的质粒过多，你要根据酶活定义来调整加入质粒的量，而不是什么多少ul，这么说没任何意义
3、去磷酸化不彻底，但是promega的酶还是ok的，所以我觉得1、2的可能性高
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2楼2009-05-07 13:55:09
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zhangqshijf2003

金虫 (小有名气)
质粒纯度和浓度不详，纯度太低切不动，浓度太高酶切不充分，去磷酸化不彻底
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3楼2009-05-07 14:04:15
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tuotuozw

银虫 (小有名气)
★
安静的位置i(金币+1,VIP+0): 5-11 19:19
XhoI 虽然是粘端，但其连接效率等于平端，所以你按照平端的连接条件吧！
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4楼2009-05-07 14:37:20
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anik

银虫 (正式写手)
各楼上的见解很好。。。
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5楼2009-05-07 14:41:13
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
xho I一点都不难连……
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6楼2009-05-07 15:24:04
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xlongw1773

金虫 (小有名气)

博士
★ ★
安静的位置i(金币+2,VIP+0): 5-8 10:47
xho I酶比较奇怪，正常的PCR引物设计是末端加三个碱基做保护性碱基，就可以了，二xhoI 最好用四个，才能比较好切，再不行就连接T载体，从里面切出来，保证目的片段切完全。
连接吗，要用平端连接的条件。
单酶切连接载体用量要比双酶切用量大很多。所以载体也要切好，连接对照最好能一个不长。
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123
7楼2009-05-07 18:48:23
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安静的位置i

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xlongw1773 at 2009-5-7 18:48:
xho I酶比较奇怪，正常的PCR引物设计是末端加三个碱基做保护性碱基，就可以了，二xhoI 最好用四个，才能比较好切，再不行就连接T载体，从里面切出来，保证目的片段切完全。
连接吗，要用平端连接的条件。
单酶切 ...

我就是连到了T载体上，而且载体自连的对照一个也没长。。。也许应该多加些载体。
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8楼2009-05-07 22:39:24
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xlongw1773

金虫 (小有名气)

博士
做个连接梯度。我曾有此单酶切连接，怎么都连不进去，后来把载体和基因的用量颠倒了下，结果长了一板子，全是阳性。
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123
9楼2009-05-08 10:01:26
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