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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助大家啊，Overlap pcr连接不上
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yuevis

铜虫 (小有名气)
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求助大家啊，Overlap pcr连接不上
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1楼 2018-08-27 12:49:57
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yuevis

铜虫 (小有名气)
我做四个片段连在一起，先把中间两个overlap连上了，接近1000bp，剩下两个片段都接近500bp，这三个片段分别pcr都能扩增出来，但是overlap怎么都连不上，我用的是phanta酶，扩增总是从在很大的条带（大于2000bp）处开始弥散涂带，我用taq酶做overlap的话，在1000处有个弱条带，剩下也是弥散涂带。三个片段重叠区有30bp，Tm68度左右，68度试过，从68度往下降落也试过，也试过两步分开先不加引物，之后再加，以及开始就加引物的方法，都没有效果。之前怀疑是不是退火温度的问题导致没连上，可是几个温度都试了。求助各位给点意见。

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3楼2018-08-27 12:50:05
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yuevis

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by xmcsxq0606 at 2018-08-28 20:45:37
弥散很可能是片段GC富集，或者引物3'端GC富集。你这重叠30bp足够，我们都用15bp

如果片段GC富集，有什么方法可以改进吗

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11楼2018-08-29 08:21:46
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yuevis

铜虫 (小有名气)
求求各位，给点意见啊

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7楼2018-08-27 12:57:15
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Tc148

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
试试俩俩overlap

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8楼2018-08-27 14:45:56
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yuevis

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Tc148 at 2018-08-27 14:45:56
试试俩俩overlap

试了，条带很暗，胶收在pcr就没有了，全是涂带

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9楼2018-08-27 16:00:42
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xmcsxq0606

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
弥散很可能是片段GC富集，或者引物3'端GC富集。你这重叠30bp足够，我们都用15bp

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10楼2018-08-28 20:45:37
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xmcsxq0606

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
11楼: Originally posted by yuevis at 2018-08-29 08:21:46
如果片段GC富集，有什么方法可以改进吗
...

看你的描述，你的酶适合GC富集扩增，排除模板引物降解试剂污染，考虑下模板量不要加多 退火温度60 62

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12楼2018-08-29 08:57:39
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yuevis

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by xmcsxq0606 at 2018-08-29 08:57:39
看你的描述，你的酶适合GC富集扩增，排除模板引物降解试剂污染，考虑下模板量不要加多 退火温度60 62
...

好的

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13楼2018-08-29 09:17:34
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坏山药2楼
2018-08-27 12:50   回复  
yuevis(金币+3): 谢谢参与
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andrewhf4楼
2018-08-27 12:50   回复  
yuevis(金币+4): 谢谢参与
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hdchina20105楼
2018-08-27 12:50   回复  
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zxthx6楼
2018-08-27 12:51   回复  
yuevis(金币+1): 谢谢参与
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