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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pMD19-T载体连接，怎么都连接不上是怎么回事？求大神
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关Q想毕业

新虫 (小有名气)

[求助] pMD19-T载体连接，怎么都连接不上是怎么回事？求大神 已有6人参与

我的目的片段36Kb左右，用的酶是TaKaRa的PreMix Taq，连接体系是1μl19-T，1.5μl回收产物，2.5μl水，5μlSolution Ⅰ，16°C，30分钟，转入DH5α感受态，然后用氨苄板筛，然后做菌液pcr。
同一株困用19-T的通用引物P一遍，用我自己目的基因的特异引物P一遍，我挑了50个菌落，什么都没有P出来，不管是T载体的还是我自己目的基因的，都没有P出来，请问大神们是哪里出了问题？
还有一个问题想请教，我看这个19-T载体的说明书说什么蓝白菌落的，我怎么没有遇到，还有和19-T载体装在一起的那个Control Insert是什么，我的体系里没有正常吗？

@youlinglyw 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2018-08-05 22:15:07
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macgray11

禁虫 (小有名气)
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本帖内容被屏蔽
6楼2018-08-06 14:12:51
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雨儿天0320

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 关Q想毕业 at 2018-08-06 15:51:31
感谢回复，我还有个相对小点的目的基因，大概2000左右，这个可以30分钟吗？我还有个疑惑就是如果没连接上的话，用氨苄板筛不是应该筛不出来吗？请教
...

2000的话你可以连接1h看看，没连接成功的话，平板上长的菌应该是大肠杆菌本身吧，做菌液PCR看出是否连接进去
；另外X-Gal和IPTG蓝白斑一般是区分自连的特征
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14楼2018-08-07 10:43:23
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晓风晚唱

铜虫 (小有名气)
36K反应30min不够吧

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2楼2018-08-06 09:09:04
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Agonilb

新虫 (小有名气)
目的片段会不会太大了，PMD19-T也就是2600多，我一般加4μl回收产物产物，连三个小时，你可试试过夜。

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3楼2018-08-06 10:12:22
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关Q想毕业

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Agonilb at 2018-08-06 10:12:22
目的片段会不会太大了，PMD19-T也就是2600多，我一般加4μl回收产物产物，连三个小时，你可试试过夜。

感谢回复，我忘了说一点，我用氨苄板筛的，每次都长出很多，但是菌液pcr却P不出T载体的带，这是怎么回事？

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4楼2018-08-06 10:49:50
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关Q想毕业

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晓风晚唱 at 2018-08-06 09:09:04
36K反应30min不够吧

感谢回复，我忘了说一点，我用氨苄板筛的，每次都长出很多，但是菌液pcr却P不出T载体的带，这是怎么回事？

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5楼2018-08-06 10:50:00
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雨儿天0320

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也认为你的目的片段太大了，可以试试过夜连接
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7楼2018-08-06 14:40:12
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关Q想毕业

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 雨儿天0320 at 2018-08-06 14:40:12
我也认为你的目的片段太大了，可以试试过夜连接

感谢回复，我还有个相对小点的目的基因，大概2000左右，这个可以30分钟吗？我还有个疑惑就是如果没连接上的话，用氨苄板筛不是应该筛不出来吗？请教

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8楼2018-08-06 15:51:31
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关Q想毕业

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by macgray11 at 2018-08-06 14:12:51
你的目的片段不是36K吧，这个也太大了，如果真是这么大，我建议分几个小段克隆吧。蓝白斑是需要加入IPTG和X-GAL的平板才能筛选的，你的平板应该是正常的，所以只长白斑吧。

感谢回复，我还有个相对小点的目的基因，大概2000左右，这个可以30分钟吗？我还有个疑惑就是如果没连接上的话，用氨苄板筛不是应该筛不出来吗？请教

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9楼2018-08-06 15:52:08
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macgray11

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
10楼2018-08-06 16:53:37
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