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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pMD19-T载体连接，怎么都连接不上是怎么回事？求大神
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关Q想毕业

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by macgray11 at 2018-08-06 16:53:37
2000bp三十分钟可以了，你可以把你长得斑去测序一下，看看到底是什么，应该就能解决你的疑问了...

好的，非常感谢您的回复

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11楼2018-08-06 17:08:23
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晓风晚唱

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 关Q想毕业 at 2018-08-06 08:52:08
感谢回复，我还有个相对小点的目的基因，大概2000左右，这个可以30分钟吗？我还有个疑惑就是如果没连接上的话，用氨苄板筛不是应该筛不出来吗？请教
...

载体自连

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12楼2018-08-06 19:56:25
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关Q想毕业

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 晓风晚唱 at 2018-08-06 19:56:25
载体自连
...

感谢回复，请问载体自连的话，我板上长出来的是纯粹的T载体吗？那菌液pcr为什么P不出T载体的带

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13楼2018-08-06 20:10:46
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雨儿天0320

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 关Q想毕业 at 2018-08-06 15:51:31
感谢回复，我还有个相对小点的目的基因，大概2000左右，这个可以30分钟吗？我还有个疑惑就是如果没连接上的话，用氨苄板筛不是应该筛不出来吗？请教
...

2000的话你可以连接1h看看，没连接成功的话，平板上长的菌应该是大肠杆菌本身吧，做菌液PCR看出是否连接进去
；另外X-Gal和IPTG蓝白斑一般是区分自连的特征
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14楼2018-08-07 10:43:23
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关Q想毕业

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 雨儿天0320 at 2018-08-07 10:43:23
2000的话你可以连接1h看看，没连接成功的话，平板上长的菌应该是大肠杆菌本身吧，做菌液PCR看出是否连接进去
；另外X-Gal和IPTG蓝白斑一般是区分自连的特征...

感谢回复，我师姐说抗氨苄的基因在T载体上，如果没有转进去不是应该长不出来吗？我的意思是能长出来的大肠杆菌最起码是，就算没有连上我的基因，但是T载体转进去的大肠杆菌吧，可是我做菌液pcr见T载体也没有显示条带，是怎么回事？是不是我哪里有什么遗漏？

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15楼2018-08-07 10:51:17
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ll19841008

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

片段太大了，另外2K的如果不好连接可以建议放在4度连接过夜，同时要检测下solution1，容易失活。
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16楼2018-11-07 11:21:21
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

片段太长，连不上，连上也很难转化。没有显示底物的培养基是看不出蓝白斑的。
用连接产物做PCR，看有没有连接上。
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17楼2018-11-07 16:16:54
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小幸运！

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 关Q想毕业 at 2018-08-06 10:50:00
感谢回复，我忘了说一点，我用氨苄板筛的，每次都长出很多，但是菌液pcr却P不出T载体的带，这是怎么回事？
...

我也遇到这样的问题了，pmd19t载体转进DH5a了，也涂了amp的板子，菌落正常生长，但是pcr，凝胶电泳检测，无亮条带

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18楼2019-03-12 09:10:46
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buchongyang

铜虫 (小有名气)
楼主现在做出来了吗？

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19楼2019-03-20 22:57:51
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buchongyang

铜虫 (小有名气)
楼主现在做出来了吗？什么问题？

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20楼2019-03-20 23:02:45
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