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关Q想毕业

新虫 (小有名气)

[求助] pMD19-T载体连接,怎么都连接不上是怎么回事?求大神 已有6人参与

我的目的片段36Kb左右,用的酶是TaKaRa的PreMix Taq,连接体系是1μl19-T,1.5μl回收产物,2.5μl水,5μlSolution Ⅰ,16°C,30分钟,转入DH5α感受态,然后用氨苄板筛,然后做菌液pcr。
同一株困用19-T的通用引物P一遍,用我自己目的基因的特异引物P一遍,我挑了50个菌落,什么都没有P出来,不管是T载体的还是我自己目的基因的,都没有P出来,请问大神们是哪里出了问题?
还有一个问题想请教,我看这个19-T载体的说明书说什么蓝白菌落的,我怎么没有遇到,还有和19-T载体装在一起的那个Control Insert是什么,我的体系里没有正常吗?

@youlinglyw 发自小木虫IOS客户端
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雨儿天0320

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 关Q想毕业 at 2018-08-06 15:51:31
感谢回复,我还有个相对小点的目的基因,大概2000左右,这个可以30分钟吗?我还有个疑惑就是如果没连接上的话,用氨苄板筛不是应该筛不出来吗?请教
...

2000的话你可以连接1h看看,没连接成功的话,平板上长的菌应该是大肠杆菌本身吧,做菌液PCR看出是否连接进去
;另外X-Gal和IPTG蓝白斑一般是区分自连的特征
14楼2018-08-07 10:43:23
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晓风晚唱

铜虫 (小有名气)

2楼2018-08-06 09:09:04
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Agonilb

新虫 (小有名气)

目的片段会不会太大了,PMD19-T也就是2600多,我一般加4μl回收产物产物,连三个小时,你可试试过夜。

发自小木虫Android客户端
3楼2018-08-06 10:12:22
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关Q想毕业

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Agonilb at 2018-08-06 10:12:22
目的片段会不会太大了,PMD19-T也就是2600多,我一般加4μl回收产物产物,连三个小时,你可试试过夜。

感谢回复,我忘了说一点,我用氨苄板筛的,每次都长出很多,但是菌液pcr却P不出T载体的带,这是怎么回事?

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4楼2018-08-06 10:49:50
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