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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】转化问题，急！
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zijing7391

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助】转化问题，急！

新手，最近做转化一直都是什么菌都不长，不知道问题出在哪里，请各位高手帮忙分析一下，前几次一直用买的T载体和买的感受态细胞进行转化，也做了对照，结果什么都不长，最近自己做了感受态细胞，还是什么也不长，抗生素浓度用的是100ug/ml，应该怎么检测感受态细胞是不是好用？怎么才能让它长菌啊，郁闷，请各位高手指点！非常感谢！

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-9 at 11:58 ]
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1楼 2009-03-12 14:43:04
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zl382

铁虫 (小有名气)
把你转化的步骤写上来，如实详细地写
你这么说不知道你问题出在哪里了。
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后退，绝对是无路可走！
2楼2009-03-12 15:00:46
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zzm7806

★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论，欢迎常来~ 3-13 09:03
检测感受态是否好用，可以转化阳性质粒鉴定。
具体问题出在哪里，还得看到你的转化步骤才知道
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3楼2009-03-13 08:51:30
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飞侠8683

新虫 (小有名气)
同意楼上的说法
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4楼2009-03-13 11:21:18
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
做一个阳性对照,应该能出来,否则就是感受态的问题
最好把你的步骤写出来,看是不是你的转化过程出错了
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5楼2009-03-13 13:01:18
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zijing7391

新虫 (初入文坛)
★ ★
lwf991229(金币+2,VIP+0):感谢参与讨论~ 3-18 14:48
转化的具体步骤：
1.将连接产物加入到100Ul的感受态细胞中，冰上放置30min
2.42度水浴60-90s
3.冰上放置1min
4.加入37度预热的培养基890ul
5.37度150转培养45分钟
6.取200UL涂平板，37度过夜培养
这是我的具体过程，做的对照也不长。但是我买的感受态细胞也是这么做的也不长啊，买的感受态也不好用吗？
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6楼2009-03-17 22:21:53
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
没连上……
你转一个环化的质粒看看
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7楼2009-03-18 00:00:29
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石头1798

新虫 (初入文坛)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~3Q~ 3-18 14:49
wo的具体步骤：
1.将连接产物加入到500Ul的感受态细胞中，冰上放置30min
2.42度水浴60-90s
3.冰上放置1min
4.加入37度预热的培养基800ul
5.37度150转培养60分钟
6.4200rpm离心10分钟
7.吸上清800弃掉，剩下吹散后涂板，37度过夜培养

请作参考！
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8楼2009-03-18 08:46:32
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qiangfeng

金虫 (小有名气)

我的转化步骤

★ ★
lwf991229(金币+2,VIP+0):鼓励新虫~ 3-18 14:49
（1）从-70℃冰箱中取出大肠杆菌DH5α感受态，置冰上备用;
（2）取连接产物5 μL加入到200 μL大肠杆菌DH5α感受态中混匀,冰上放置30min；
（3）42℃水浴热击90sec，期间不要晃动EPP管，热击结束后立刻放冰上5min；
（4）在EPP管中加入800μL不含抗生素的LB培养基，37℃230-250rpm震荡培养1小时；
（5）8000rpm离心2min，弃上清，留下60-100μL涂板；
（6）将剩余转化液均匀涂布在含有Amp抗性的LB平板上，用Parafilm封口，
37℃在恒温箱中倒置培养12-16 h或过夜培养。

注：我们用的抗生素浓度一般为：
Kan初浓度为 50mg/ml或100mg/ml
Amp初浓度为 50mg/ml或100mg/ml

个人感觉：我认为转化成功与否，关键是感受态质量的好坏，如果感受态质量好的话，转化一般没问题。
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顺势而行，问心无愧！
9楼2009-03-18 12:21:17
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崔红利

新虫 (正式写手)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~ 3-18 14:50
我本人认为你的转化步骤中的第五步有点问题啊，活化的时候刚开始应该转速调低一点，可以参考：50转每分钟，15分钟    100转每分钟  15分钟    150转每分钟   20分钟    然后5000转每分钟离心3分钟   剩余150微升左右进行涂板。
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10楼2009-03-18 13:00:23
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