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zijing7391

新虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助】转化问题，急！

新手，最近做转化一直都是什么菌都不长，不知道问题出在哪里，请各位高手帮忙分析一下，前几次一直用买的T载体和买的感受态细胞进行转化，也做了对照，结果什么都不长，最近自己做了感受态细胞，还是什么也不长，抗生素浓度用的是100ug/ml，应该怎么检测感受态细胞是不是好用？怎么才能让它长菌啊，郁闷，请各位高手指点！非常感谢！

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-9 at 11:58 ]

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1楼 2009-03-12 14:43:04

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qiangfeng

金虫 (小有名气)

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虫号: 722794
注册: 2009-03-14
性别: GG
专业: 生物化学

我的转化步骤

★ ★
lwf991229(金币+2,VIP+0):鼓励新虫~ 3-18 14:49

（1）从-70℃冰箱中取出大肠杆菌DH5α感受态，置冰上备用;
（2）取连接产物5 μL加入到200 μL大肠杆菌DH5α感受态中混匀,冰上放置30min；
（3）42℃水浴热击90sec，期间不要晃动EPP管，热击结束后立刻放冰上5min；
（4）在EPP管中加入800μL不含抗生素的LB培养基，37℃230-250rpm震荡培养1小时；
（5）8000rpm离心2min，弃上清，留下60-100μL涂板；
（6）将剩余转化液均匀涂布在含有Amp抗性的LB平板上，用Parafilm封口，
37℃在恒温箱中倒置培养12-16 h或过夜培养。

注：我们用的抗生素浓度一般为：
Kan初浓度为 50mg/ml或100mg/ml
Amp初浓度为 50mg/ml或100mg/ml

个人感觉：我认为转化成功与否，关键是感受态质量的好坏，如果感受态质量好的话，转化一般没问题。