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丝状真菌基因敲除，转化子假阳性过多
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大家好。本人最近在做一种丝状真菌基因敲除实验。用的是PEG介导转化的方法，实验过程与步骤没有什么大的问题，也可以拿到转化子，但是在后期验证的过程中发现转化子都是假阳性。目的基因未能被敲掉，但是潮霉素基因已被整和到真菌的基因组上。在后期的实验中，调整了原生质体的浓度，转化片段的浓度，均未获得正确的转化子。 请各位大神提供一下指导意见或者改进措施能够减少假阳性的概率，提高基因敲除效率。（原生质体的制备与转化没问题，可以获得转化子，但是转化子均是假阳性，目的基因和潮霉素基因都存在） |
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最近在做丝状真菌原生质体转化，由于孢子形状椭圆形近似圆形，所以打算用菌丝做。将孢子直接放到LB摇瓶中摇 ，瓶子放了0.1mm的玻璃珠，成大小不一的菌丝球，对球未做任何处理直接酶解 时用的是 0.1%Driselase +0.05% lysing enzymes ，渗透压保护剂是0.7M氯化钾和10nM的氯化钙，30度，180rpm 酶解3h，三层滤纸1层Miracloth过滤后，滤液离心未有原生质体沉淀。 考虑菌丝球太大不易酶解，故把10的6次方每ml的孢子涂玻璃纸，收集菌丝酶解。每个平板10ml的酶解液， 四种酶组合：0.5%Driselase+0.3% lysing enzymes+2%snailase 和0.5% 纤维素酶，渗透压保护剂同上，30度，220rpm 酶解3-4h 后镜检未发现断裂的的菌丝，更不用说心心盼盼的原生质体了。感觉从外观上看酶解前后未有变化。 不知道做不出原生质体的问题出在哪？摇成的菌丝球或者从玻璃板上收集到的菌丝需要进一步破碎？用均质仪？才能进行酶解？ 求做过丝状真菌原生质体转化的大神指点一番 不胜感激！ 你能指导下吗 我连原生质体都拿不到  |
4楼2018-01-31 09:44:16
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