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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 丝状真菌基因敲除，转化子假阳性过多
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汤锐5211314

新虫 (初入文坛)

[求助] 丝状真菌基因敲除，转化子假阳性过多

大家好。本人最近在做一种丝状真菌基因敲除实验。用的是PEG介导转化的方法，实验过程与步骤没有什么大的问题，也可以拿到转化子，但是在后期验证的过程中发现转化子都是假阳性。目的基因未能被敲掉，但是潮霉素基因已被整和到真菌的基因组上。在后期的实验中，调整了原生质体的浓度，转化片段的浓度，均未获得正确的转化子。
    请各位大神提供一下指导意见或者改进措施能够减少假阳性的概率，提高基因敲除效率。（原生质体的制备与转化没问题，可以获得转化子，但是转化子均是假阳性，目的基因和潮霉素基因都存在）
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1楼2018-01-29 18:44:39
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汤锐5211314

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 199006287956 at 2018-01-29 20:16:41

什么情况？你知道我的问题怎么解决吗？
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3楼2018-01-29 20:40:19
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汤锐5211314

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by A00696 at 2018-01-31 09:44:16
最近在做丝状真菌原生质体转化，由于孢子形状椭圆形近似圆形，所以打算用菌丝做。将孢子直接放到LB摇瓶中摇 ，瓶子放了0.1mm的玻璃珠，成大小不一的菌丝球，对球未做任何处理直接酶解 时用的是 0.1%Driselase +0.05 ...

分生孢子摇培培养基是用的LB吗？看你写到的是丝状真菌，我不太了解你的真菌，我做过的几种丝状真菌都没有放在LB中摇培的，有的是在YEPD或者PDB液体培养基中。直接收集分生孢子后，加入到摇培培养基中，培养温度以及转速对于后期的菌丝酶解处理也有一定的影响。


不建议直接酶解从玻璃纸收集的菌丝，这样的菌丝过老，不容易酶解。这个方法我之前用过，不太靠谱。
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6楼2018-02-07 09:34:59
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汤锐5211314

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by an安琳 at 2018-07-17 22:41:47
你好 请问鉴定是否敲除成功 除了提DNA 你还用别的方法了吗 谢谢...

southern

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17楼2018-11-05 14:56:36
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汤锐5211314

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 小耗子偷灯油 at 2018-08-23 21:49:33
您好我想问一下我在做原生质体转化的时候，转不进去，转潮霉素的空载体也转不进去，是因为什么啊？

用的PEG吗？是的话看看这个有问题吗？

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18楼2018-11-05 14:57:18
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