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丝状真菌基因敲除，转化子假阳性过多
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大家好。本人最近在做一种丝状真菌基因敲除实验。用的是PEG介导转化的方法，实验过程与步骤没有什么大的问题，也可以拿到转化子，但是在后期验证的过程中发现转化子都是假阳性。目的基因未能被敲掉，但是潮霉素基因已被整和到真菌的基因组上。在后期的实验中，调整了原生质体的浓度，转化片段的浓度，均未获得正确的转化子。 请各位大神提供一下指导意见或者改进措施能够减少假阳性的概率，提高基因敲除效率。（原生质体的制备与转化没问题，可以获得转化子，但是转化子均是假阳性，目的基因和潮霉素基因都存在） |
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7楼2018-03-13 22:10:33
A00696
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最近在做丝状真菌原生质体转化，由于孢子形状椭圆形近似圆形，所以打算用菌丝做。将孢子直接放到LB摇瓶中摇 ，瓶子放了0.1mm的玻璃珠，成大小不一的菌丝球，对球未做任何处理直接酶解 时用的是 0.1%Driselase +0.05% lysing enzymes ，渗透压保护剂是0.7M氯化钾和10nM的氯化钙，30度，180rpm 酶解3h，三层滤纸1层Miracloth过滤后，滤液离心未有原生质体沉淀。 考虑菌丝球太大不易酶解，故把10的6次方每ml的孢子涂玻璃纸，收集菌丝酶解。每个平板10ml的酶解液， 四种酶组合：0.5%Driselase+0.3% lysing enzymes+2%snailase 和0.5% 纤维素酶，渗透压保护剂同上，30度，220rpm 酶解3-4h 后镜检未发现断裂的的菌丝，更不用说心心盼盼的原生质体了。感觉从外观上看酶解前后未有变化。 不知道做不出原生质体的问题出在哪？摇成的菌丝球或者从玻璃板上收集到的菌丝需要进一步破碎？用均质仪？才能进行酶解？ 求做过丝状真菌原生质体转化的大神指点一番 不胜感激！ 你能指导下吗 我连原生质体都拿不到  |
4楼2018-01-31 09:44:16
6楼2018-02-07 09:34:59
8楼2018-03-27 17:14:29
2楼2018-01-29 20:16:41
3楼2018-01-29 20:40:19
5楼2018-02-01 13:56:40
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snoopytbw: 金币+2, 略有帮助 2018-04-09 09:12:28
snoopytbw: 金币+2, 略有帮助 2018-04-09 09:12:28
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你拿到转化子的时候可提取DNA用片段内部引物对其进行鉴定？我做的时候都是从转化板上单独挑出来进行一次鉴定才能初步确认是否敲除成功。 发自小木虫IOS客户端 |
9楼2018-04-08 20:01:40
10楼2018-04-08 20:03:08
5