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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » EMSA/ChIP » 求大神解答，为什么我的TA克隆重组一直连不上去
汕头大学海洋科学接受调剂
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Michael ~

新虫 (初入文坛)

[交流] 求大神解答，为什么我的TA克隆重组一直连不上去 已有6人参与

我用的载体是PUC19-GFP，目的片段是1300多bp。加A反应体系：dd水 0.3ul，PCR扩增片段 20ul,Buffer 2.5ul,dNTP 2ul.rTaq 0.2ul,反应条件72℃30min。载体骨架和目的片段胶回收纯化之后浓度和纯度都很好，连接体系就是1:2,1:8,1:16都用过，而且也把三种比例放一个板上转化过，都没有成功，一个斑都没有
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1楼 2018-01-22 11:36:43
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
转化对照做了吗？
抗生素？
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
2楼2018-01-23 03:07:12
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hubeigxkkk

新虫 (初入文坛)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-02-17 12:17:56
连接比列不是很关键。你的这个是T载体吗？以前TA克隆有问题吗？感受态有问题吗？你描述的也不清楚，中间很多环节都有可能有问题
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3楼2018-01-25 15:42:33
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遊俠

新虫 (小有名气)
★
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这个加A体系。。合适吗？

发自小木虫Android客户端
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4楼2018-01-29 23:22:58
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Michael ~

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-01-23 03:07:12
转化对照做了吗？
抗生素？

转化对照没做，抗生素会出什么问题么
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5楼2018-02-04 20:36:05
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Michael ~

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 遊俠 at 2018-01-29 23:22:58
这个加A体系。。合适吗？

求问什么体系合适啊，我也是刚接触不太懂。另外这两天用rTaq和Ex-Taq P目的片段也没长斑，是不是证明了不是加A的问题了？
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6楼2018-02-04 20:43:08
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GRUBBY_WU

铁杆木虫 (著名写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-02-17 12:18:12
PUC19-GFP是T载体吗？T载体一般不都是pXX-T Vector，像pGEM-T、pUC18-T、pMD18-T
我们用takara的pMD™18 -T Vector，云盘是详细的流程，你可以参考下，链接: https://pan.baidu.com/s/1kWYepsb 密码: 8tfa
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2019更好更棒!
7楼2018-02-05 10:49:10
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peitaokong

银虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-02-17 12:18:29
你加GFP的标签，不叫TA克隆的。你这种重组质粒的构建和TA克隆还是有差别的，我建议先确定清楚了再做，这两种方法不太一样的。
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8楼2018-02-05 11:16:27
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drwhoknowss

荣誉版主 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Michael ~ at 2018-02-04 20:36:05
转化对照没做，抗生素会出什么问题么...

做了再讨论
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Progress in science depends on new techniques, new discoveries and new ideas, probably in that order. -- Nobel laureate Sydney Brenner
9楼2018-02-05 11:57:36
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Michael ~

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by GRUBBY_WU at 2018-02-05 10:49:10
PUC19-GFP是T载体吗？T载体一般不都是pXX-T Vector，像pGEM-T、pUC18-T、pMD18-T
我们用takara的pMD™18 -T Vector，云盘是详细的流程，你可以参考下，链接: https://pan.baidu.com/s/1kWYepsb 密码: 8tfa...

好的，谢谢了
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10楼2018-02-10 11:30:16
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