求大神解答，为什么我的TA克隆重组一直连不上去 - 分子生物 - EMSA/ChIP - 第2页小木虫论坛-学术科研互动平台

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Michael ~

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8楼: Originally posted by peitaokong at 2018-02-05 11:16:27
你加GFP的标签，不叫TA克隆的。你这种重组质粒的构建和TA克隆还是有差别的，我建议先确定清楚了再做，这两种方法不太一样的。

为什么加GFP就不叫？我用XcmI酶切之后都是突出的T啊，然后目的片段两端都必须有突出的A才能连啊。

11楼2018-02-10 11:33:33

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Michael ~

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9楼: Originally posted by drwhoknowss at 2018-02-05 11:57:36
做了再讨论

...

转化对照是直接用感受态涂板？

12楼2018-02-10 11:34:53

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Michael ~

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7楼: Originally posted by GRUBBY_WU at 2018-02-05 10:49:10
PUC19-GFP是T载体吗？T载体一般不都是pXX-T Vector，像pGEM-T、pUC18-T、pMD18-T
我们用takara的pMD™18 -T Vector，云盘是详细的流程，你可以参考下，链接: https://pan.baidu.com/s/1kWYepsb 密码: 8tfa...

请问这个载体是现成的空载，买来可以直接连的么？

13楼2018-02-10 11:45:24

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GRUBBY_WU

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13楼: Originally posted by Michael ~ at 2018-02-10 11:45:24
请问这个载体是现成的空载，买来可以直接连的么？...

线性空载，可以直接连有a尾的pcr产物

2019更好更棒!

14楼2018-02-10 12:57:09

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peitaokong

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11楼: Originally posted by Michael ~ at 2018-02-10 11:33:33
为什么加GFP就不叫？我用XcmI酶切之后都是突出的T啊，然后目的片段两端都必须有突出的A才能连啊。...

TA克隆方法是把PCR片断与一个具有3'-T突出的载体DNA连接起来的方法。
有目的基因，有质粒，进行双酶切，然后用酶使两者相接就是重组质粒。你的这个叫做重组质粒。希望对你有所帮助。

15楼2018-02-10 13:05:05

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Korea??

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我也在做和你类似的实验，还没成功过

，快过年了，停手看看书，年后继续找问题，加油

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16楼2018-02-12 06:50:06

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Michael ~

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14楼: Originally posted by GRUBBY_WU at 2018-02-10 12:57:09
线性空载，可以直接连有a尾的pcr产物...

好的，谢谢了

17楼2018-02-16 22:38:28

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6楼: Originally posted by Michael ~ at 2018-02-04 20:43:08
求问什么体系合适啊，我也是刚接触不太懂。另外这两天用rTaq和Ex-Taq P目的片段也没长斑，是不是证明了不是加A的问题了？...

那。。就不好说了，就用一般含有普通taq酶的mix保温即可，也可以加之前的引物用这个mix 再扩增一次。你这个情况，如果知道目的序列的话，先去测个序验证一下呗

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18楼2018-02-17 22:10:39

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遊俠

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6楼: Originally posted by Michael ~ at 2018-02-04 20:43:08
求问什么体系合适啊，我也是刚接触不太懂。另外这两天用rTaq和Ex-Taq P目的片段也没长斑，是不是证明了不是加A的问题了？...

还有，你是酶切酶连的，酶切这块儿很容易出问题，导致后期连接不成功。

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19楼2018-02-17 22:13:19

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16楼: Originally posted by Korea?? at 2018-02-12 06:50:06
我也在做和你类似的实验，还没成功过

，快过年了，停手看看书，年后继续找问题，加油

一起加油撒

20楼2018-03-09 17:20:55

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