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13011231322新虫 (小有名气)
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转录组测序数据分析的结果和荧光定量验证的结果不一致已有3人参与
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转录组数据分析的出来的差异表达基因倍数比较大，但是荧光定量验证后并没有显著性差异，分析差异表达的基因的readcount一般在多少比较比较合适？ 发自小木虫Android客户端 |
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 测序 QPCR |
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2楼2018-01-09 15:38:48
13011231322
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3楼2018-01-09 23:54:28
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4楼2018-01-10 00:49:11
【答案】应助回帖
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本来转录组测序和qPCR结果就有不同的可能性： 首先回答Read Counts的问题： 1. 我一般认为Counts，单样本在5以上，生物学重复在10以上（当然是指至少一个分组中，不是要求两组都是）的基因分析出来的差异基因是可以验证。比如一组数据case组 5 5 对照组0 0.那么保留；如果case 2 2 对照组0 0则还是算了，别考虑了。 2. 验证率高的，我一般考虑RPKM至少在一个分组中都大于1的基因进行后续验证，验证成功率较高。 3. 差异倍数往往需要查看生物学重复数量，如果生物学重复3，则需要2倍以上差异，6-12个之间可以采纳1.5倍差异，12个以上可以采纳仅考虑FDR<0.05的数据 其次，其实这不一定是测序的问题，在RNA-Seq中常规会将不同的转录本合并为一个转录本，也就是说，如果该基因存在特别复杂的转录本形式，会产生qPCR表达不准的问题，并且有时候假基因还会干扰基因表达： 1. qPCR的引物尽可能全都设计在基因的转录本共有外显子上，别是某些特定转录本的，这样qPCR会增大失败可能。 2. qPCR引物设计的时候需要上NCBI做Primer Blast，保证引物别能够Blast到一些基因组上的假基因上，这就会把（真实基因表达+假基因表达）/2分析了。这样就不准确了，这是一个大坑 |
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130112313225楼2018-01-15 09:57:54
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6楼2018-01-17 15:21:04
【答案】应助回帖
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1.不一致的程度分析： A.验证30个基因，25个表达趋势一致； B.验证30个基因，15个表达趋势一致； C.验证30个基因，5个表达趋势一致； D.验证3个基因，1个表达趋势一致。 2.首先，思考可能存在的原因？ 如D情况，随机出现的概率会比较大，属于验证实验设计不合理，不作为讨论范围。 如A情况，属于结果一致，为了更好的表示是否一致，建议计算30个基因的相关性系数，趋势只反映上下调，不能反映倍数。一般相关性系数大于0.8，说明一致性较好 如C情况，优先考虑是否是实验组与对照组在某个实验中设置颠倒。 如B情况，相对复杂，需要一步一步来排查 引自：http://www.planttech.com.cn/blog/db3347ad80c |
7楼2018-01-22 12:57:46