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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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13011231322

新虫 (小有名气)

[求助] 转录组测序数据分析的结果和荧光定量验证的结果不一致 已有3人参与

转录组数据分析的出来的差异表达基因倍数比较大,但是荧光定量验证后并没有显著性差异,分析差异表达的基因的readcount一般在多少比较比较合适?

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woogie

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

本来转录组测序和qPCR结果就有不同的可能性:
首先回答Read Counts的问题:
1.        我一般认为Counts,单样本在5以上,生物学重复在10以上(当然是指至少一个分组中,不是要求两组都是)的基因分析出来的差异基因是可以验证。比如一组数据case组 5 5 对照组0 0.那么保留;如果case 2 2 对照组0 0则还是算了,别考虑了。
2.        验证率高的,我一般考虑RPKM至少在一个分组中都大于1的基因进行后续验证,验证成功率较高。
3.        差异倍数往往需要查看生物学重复数量,如果生物学重复3,则需要2倍以上差异,6-12个之间可以采纳1.5倍差异,12个以上可以采纳仅考虑FDR<0.05的数据
其次,其实这不一定是测序的问题,在RNA-Seq中常规会将不同的转录本合并为一个转录本,也就是说,如果该基因存在特别复杂的转录本形式,会产生qPCR表达不准的问题,并且有时候假基因还会干扰基因表达:
1.        qPCR的引物尽可能全都设计在基因的转录本共有外显子上,别是某些特定转录本的,这样qPCR会增大失败可能。
2.        qPCR引物设计的时候需要上NCBI做Primer Blast,保证引物别能够Blast到一些基因组上的假基因上,这就会把(真实基因表达+假基因表达)/2分析了。这样就不准确了,这是一个大坑

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5楼2018-01-15 09:57:54
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hyuqing

捐助贵宾 (小有名气)

Enriching beads


【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-01-09 21:44:23
找找不一致的原因吧,取样条件、操作流程、人为的还是天然存在的,总之只要能重复的都是可信任的结果。
转录组数据需要进行差异分析,就是针对这一类情况。你可以去了解下差异表达基因分析。方法有很多的
2楼2018-01-09 15:38:48
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13011231322

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by hyuqing at 2018-01-09 15:38:48
找找不一致的原因吧,取样条件、操作流程、人为的还是天然存在的,总之只要能重复的都是可信任的结果。
转录组数据需要进行差异分析,就是针对这一类情况。你可以去了解下差异表达基因分析。方法有很多的

好的,谢谢。

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3楼2018-01-09 23:54:28
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Liumengya

木虫 (正式写手)

转录组还要看数据本身怎么样,二代数据常常质量较差。同时qpcr假阳性假阴性概率很高,有条件的话建议用northern试试

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4楼2018-01-10 00:49:11
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