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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 转录组测序数据分析的结果和荧光定量验证的结果不一致
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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13011231322

新虫 (小有名气)

[求助] 转录组测序数据分析的结果和荧光定量验证的结果不一致 已有3人参与

转录组数据分析的出来的差异表达基因倍数比较大，但是荧光定量验证后并没有显著性差异，分析差异表达的基因的readcount一般在多少比较比较合适？

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1楼 2018-01-09 14:50:02
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woogie

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

本来转录组测序和qPCR结果就有不同的可能性：
首先回答Read Counts的问题：
1.        我一般认为Counts，单样本在5以上，生物学重复在10以上（当然是指至少一个分组中，不是要求两组都是）的基因分析出来的差异基因是可以验证。比如一组数据case组 5 5 对照组0 0.那么保留；如果case 2 2 对照组0 0则还是算了，别考虑了。
2.        验证率高的，我一般考虑RPKM至少在一个分组中都大于1的基因进行后续验证，验证成功率较高。
3.        差异倍数往往需要查看生物学重复数量，如果生物学重复3，则需要2倍以上差异，6-12个之间可以采纳1.5倍差异，12个以上可以采纳仅考虑FDR<0.05的数据
其次，其实这不一定是测序的问题，在RNA-Seq中常规会将不同的转录本合并为一个转录本，也就是说，如果该基因存在特别复杂的转录本形式，会产生qPCR表达不准的问题，并且有时候假基因还会干扰基因表达：
1.        qPCR的引物尽可能全都设计在基因的转录本共有外显子上，别是某些特定转录本的，这样qPCR会增大失败可能。
2.        qPCR引物设计的时候需要上NCBI做Primer Blast，保证引物别能够Blast到一些基因组上的假基因上，这就会把（真实基因表达+假基因表达）/2分析了。这样就不准确了，这是一个大坑
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13011231322
5楼2018-01-15 09:57:54
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hyuqing

捐助贵宾 (小有名气)

Enriching beads

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-01-09 21:44:23
找找不一致的原因吧，取样条件、操作流程、人为的还是天然存在的，总之只要能重复的都是可信任的结果。
转录组数据需要进行差异分析，就是针对这一类情况。你可以去了解下差异表达基因分析。方法有很多的
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2楼2018-01-09 15:38:48
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13011231322

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hyuqing at 2018-01-09 15:38:48
找找不一致的原因吧，取样条件、操作流程、人为的还是天然存在的，总之只要能重复的都是可信任的结果。
转录组数据需要进行差异分析，就是针对这一类情况。你可以去了解下差异表达基因分析。方法有很多的

好的，谢谢。

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3楼2018-01-09 23:54:28
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Liumengya

木虫 (正式写手)
转录组还要看数据本身怎么样，二代数据常常质量较差。同时qpcr假阳性假阴性概率很高，有条件的话建议用northern试试

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4楼2018-01-10 00:49:11
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