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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » NEB酶切产物纯化回收率很低
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肥猫p

木虫 (正式写手)

[交流] NEB酶切产物纯化回收率很低

当质粒进行单酶切或者只切除很小的片段时，我会直接使用PCR清洁试剂盒对酶切产物进行柱回收。
在原来实验室，我用的TAKARA的内切酶和Axygen的PCR清洁试剂盒，回收率很高，一般>80%.
最近换了实验室，现在使用NEB的内切酶，酶切产物我试过生工和Axygen清洁试剂盒来回收，但是效率都很低，不超过20%。
我试过加入多倍的高盐低pH缓冲液，挂柱子时低速离心，wash buffer（已加乙醇）洗脱后空离，加热洗脱液，EB buffer或ddH2O润湿硅胶柱后静置再离心，等方法，但回收率并没有明显的提高。
PCR清洁试剂盒质量没有问题，回收PCR产物时，回收率很高。
这个是NEB的Cutsmart buffer 的成分，我觉得也没有什么特别的地方，很不理解为什么回收率会这么低。不知大家是否有遇到类似状况，是如何解决的呢？谢谢
50 mM Potassium Acetate
20 mM Tris-acetate
10 mM Magnesium Acetate
100 μg/ml BSA
pH 7.9@25°C
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朱云凯

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1楼 2017-10-28 21:57:56
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酷莱博

新虫 (小有名气)
★
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
你要收集的是多大片段的，吸附柱对大片段和小片段回收率都低。大于5000。小于500

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23楼2017-11-02 20:33:58
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小阳sunny

新虫 (初入文坛)
★
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
NEB的酶，我们实验室一直在用，因为他的buffer 能够兼容很多种酶，觉得效果还不错。没有发现是因为用NEB酶导致回收率低的

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3楼2017-10-28 23:01:19
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王查查23

禁虫 (小有名气)
★
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
本帖内容被屏蔽
7楼2017-10-28 23:24:18
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前行的璐

新虫 (小有名气)
★
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
NEB的酶切效果还是可以的，你加大酶切体系试试
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18楼2017-10-31 21:38:47
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
难道你不电泳回收？
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22楼2017-11-02 15:59:51
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朱云凯

银虫 (初入文坛)
★
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
送红花一朵
你好，请问你的问题解决了吗？最近我也遇到这样的问题，真心头疼，需要你的建议，谢谢！
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24楼2020-03-26 01:16:14
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陌笙石上菁

新虫 (初入文坛)
★
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
我现在也遇到了这个问题。用的NEB的酶，按照官网提示的双酶切反应体系，1ug的质粒，BamHI和KpnI各1ul，10×的NEBbuffer 1.1 5ul,50ul的体系，其余用ddH2O补齐。质粒提出来130ng/ul，但是酶切完用Axygen试剂盒纯化只有10以内，还有的40多但是有很多杂峰。我师姐跟我说是我体系里的质粒量太少了，50ul体系里有35.5的水，最后吸附在柱子上的肯定也少。我看文献里用的是TAKARA的酶和赛默飞的酶，但是体系也是这样的，不知道问题出在哪了。如果楼主解决了烦请跟我说一声
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25楼2021-12-20 11:25:06
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nono20092楼
2017-10-28 23:00   回复  
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
Lucyjuly7294楼
2017-10-28 23:17   回复  
肥猫p(金币+1): 谢谢参与
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Lucyjuly7295楼
2017-10-28 23:18   回复  
远方的游子6126楼
2017-10-28 23:24   回复  
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M塞北8楼
2017-10-28 23:35   回复  
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塞北先生9楼
2017-10-28 23:43   回复  
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tzynew10楼
2017-10-29 00:07   回复  
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syhorchid11楼
2017-10-29 00:07   回复  
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spc0812楼
2017-10-29 00:10   回复  
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tpw12313楼
2017-10-29 00:24   回复  
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ylheping14楼
2017-10-29 07:51   回复  
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slytjiaofei15楼
2017-10-29 11:28   回复  
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sz_kebaoyuan16楼
2017-10-29 23:19   回复  
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nono200917楼
2017-10-31 19:27   回复  
sz_kebaoyuan19楼
2017-11-01 11:31   回复  
龙老师征稿20楼
2017-11-01 11:48   回复  
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bj200898921楼
2017-11-01 19:28   回复  
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